miR-328表达对心肌梗死小鼠心脏损伤的影响及其分子机制

张乐，高艳，李连香，曹怿玮，冯景，邓麦丽

1 陕西省人民医院功能检查科，西安710068；2 陕西省人民医院妇科

微小RNA（miRNAs）是一类含有18～26 个核苷酸的具有调控性作用的内源性非编码性RNA，通过碱基互补配对与目标mRNA 结合使其降解或沉默，介导基因的转录后调控［1］。自1993 年被发现以来，miRNAs 因广泛参与细胞生长、组织分化等生物学过程而倍受关注［2］。现已证实，miRNAs 在冠心病的发生发展过程中具有重要作用。miR-328是miRNAs家族的一员，其在急性心肌梗死（AMI）患者血浆中的表达明显升高，可作为AMI 诊断的重要生物学标志物［3］。但国内外关于miR-328 对心肌梗死（MI）患者心功能的影响及其作用机制报道较少。此前GUO 等［4］研究显示，miR-328 过表达可抑制肺动脉高压患者L 型钙离子通道β 亚基（CaV2）表达，但MI发生后这一通道是否也被抑制尚未可知。2018 年10 月—2021 年 1 月，本研究观察了 miR-328 表达对MI 小鼠心脏损伤的影响，并探讨其机制是否与CaV2有关。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：健康雄性C57B/L 小鼠125只，8～10周龄，体质量20～25 g，由成都达硕实验动物有限公司提供。主要试剂：CaV2 抗体购自美国Invitrogen 公司，载有miR-328 的腺病毒溶液及载有抑制miR-328（anti miR-328）的腺病毒溶液均购自上海汉恒生物科技有限公司，miRNAs cDNA 一链合成专用试剂盒及miRNAs 通用SYBR Green Ⅰ嵌合荧光试剂盒均购自诺唯赞生物科技有限公司；75%乙醇、甲醇、HRP 标记的二抗均购自康为世纪生物科技有限公司。主要仪器：电泳仪、转膜仪均购自美国Bio-Rad公司。

1.2 动物建模与分组处理 选择C57B/L 小鼠125只，适应性饲养1周后，随机分为对照组、模型组、空病毒组、miR-328 组、anti miR-328 组，每组 25 只。除对照组外均建立MI 模型：使用3%异氟烷吸入麻醉后行气管插管，氧气通气，左外侧开胸后，用8-0 尼龙缝线结扎左前降支（LAD），心电图显示ST 段明显抬高提示建模成功。对照组开胸后不做任何处理。空病毒组、miR-328 组及anti miR-328 组分别用微量注射器吸取腺病毒载体溶液、载有miR-328 的腺病毒溶液及载有anti miR-328 的腺病毒溶液各50 mL，于梗死周围区域选取5个点进行注射；注射完毕，缝合关胸，小鼠恢复自主呼吸后拔除呼吸机。

1.3 梗死心肌组织miR-328 表达检测 采用实时荧光定量 PCR 法。各组于处理后 24 h、1 周、2 周分别取5 只小鼠处死，迅速摘取心脏，剪取梗死区域。使用TRIzol 试剂提取总RNA，茎环法检测miR-328表达，miR-328 上游引物 5′-GGACCGGGAGAGACGGG-3′，下游引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGCCTT-3′；内参U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。采用2－ΔΔCt法计算miR-328相对表达量。

1.4 梗死情况观察 采用TTC 染色。各组于处理后24 h 分别取4 只小鼠处死，迅速摘取心脏，PBS 溶液冲洗干净，置于-20 ℃冰箱中速冻15 min，取出后迅速连续切成2 mm 厚度的切片。将切片置于1%TTC 染色溶液中，37 ℃避光水浴 15 min，每 5 min 轻轻晃动以全面染色。正常区域染色为砖红色，MI区域为灰白色。使用莱卡显微镜拍照，用Image Pro Plus 6.0 分析梗死面积，计算心肌梗死率。心肌梗死率=梗死面积/左心室切面总面积×100%。

1.5 心功能检查 采用经胸超声检查。各组于处理后1 周，使用3%异氟烷麻醉剩余小鼠，使用二维引导M 型超声心动图机对小鼠心脏形态和功能进行评估，测量左心室舒张期和收缩期的壁厚和直径。取连续10个以上心动周期的平均值，计算左心室射血分数（LVEF）。

1.6 梗死心肌组织CaV2 mRNA 及蛋白表达检测取1.3中各组处理后1周的梗死心肌组织，分别检测CaV2 mRNA 及蛋白表达。①CaV2 mRNA 表达：参照1.3 采用实时荧光定量PCR 法检测心肌组织CaV2 mRNA 相 对 表 达 量 。 CaV2 上 游 引 物 5′-AAGTGTGGATCTGCAGCCAT-3′，下游引物 5′-AT-GTGTCCCCTCTCACCAGA-3′；内参 GAPDH 上游引物 5′-GGTGTGACAGTGACTTGGGA-3′，下 游 引 物5′-AAGTCGCAGGAGACAACCTG-3′。②CaV2 蛋白表达：采用Western blotting 法。取梗死心肌组织，蛋白裂解液提取总蛋白并进行定量。心脏匀浆蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上；加入CaV2、GAPDH 一抗，4 ℃孵育过夜；次日PBST 洗膜后，加入HRP 标记的二抗，室温孵育2 h。红外成像系统对膜进行扫描，使用Quantity One软件测量条带灰度值，计算CaV2蛋白相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，组间比较采用成组t检验。梗死心肌组织miR-328 与CaV2 mRNA 表达的关系采用Pearson 相关分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠梗死心肌组织miR-328 表达比较 处理后24 h、1周，对照组、anti miR-328组＜模型组、空病毒组＜miR-328组（P均＜0.05）；处理后2周，anti miR-328组＜对照组、模型组、空病毒组＜miR-328组（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠不同时间点梗死心肌组织miR-328表达比较（）

表1 各组小鼠不同时间点梗死心肌组织miR-328表达比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组和空病毒组比较，#P＜0.05。

组别对照组模型组空病毒组miR-328组anti miR-328组2周0.99±0.15 1.01±0.13 1.05±0.19 1.34±0.09*#0.67±0.07*#n 5 5 5 5 5 24 h 0.59±0.12 1.00±0.15*0.92±0.15*1.47±0.23*#0.68±0.04#1周0.51±0.15 1.06±0.40*1.15±0.20*4.26±0.54*#0.48±0.11#

2.2 各组小鼠心肌梗死率比较 对照组、模型组、空病毒组、miR-328组、anti miR-328组心肌梗死率分别为0、23.00%±2.34%、23.00%±2.75%、35.00%±5.23%、16.00% ± 3.76%，对照组、anti miR-328 组＜模型组、空病毒组＜miR-328组（P均＜0.05）。

2.3 各组小鼠LVEF 比较 对照组、模型组、空病毒 组 、miR-328 组 、anti miR-328 组 LVEF 分 别 为58.00% ± 2.53%、40.00% ± 3.88%、40.00% ±2.73%、35.00% ± 2.61%、49.00% ± 2.07%，miR-328 组＜模型组、空病毒组＜anti miR-328 组、对照组（P均＜0.05）。

2.4 各组小鼠梗死心肌组织CaV2 mRNA及蛋白表达比较 对照组、anti miR-328组＞模型组、空病毒组＞miR-328组（P均＜0.05）。见表2、OSID码图1。

表2 各组小鼠梗死心肌组织CaV2 mRNA及蛋白表达比较（）

表2 各组小鼠梗死心肌组织CaV2 mRNA及蛋白表达比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组和空病毒组比较，#P＜0.05。

组别对照组模型组空病毒组miR-328组anti miR-328组CaV2 蛋白0.67±0.08 0.41±0.07*0.46±0.04*0.21±0.03*#0.62±0.06#n 5 5 5 5 5 CaV2 mRNA 1.95±0.40 1.00±0.06*1.05±0.12*0.49±0.06*#1.76±0.15#

2.5 梗死心肌组织miR-328 与CaV2 mRNA 的相关性分析结果 梗死心肌组织miR-328 与CaV2 mRNA 相对表达量呈负相关关系（r＝-0.775，P＜0.05）。

3 讨论

心血管病是引起人类死亡的一个主要原因，MI更是危害人类健康的常见疾病［5］。心肌缺血后大量心肌细胞死亡，主要与心肌能量代谢紊乱、细胞内酸碱中毒、生物膜完整性被破坏等病理生理过程有关，但具体的分子信号通路目前尚未完全阐明。miRNAs是一类内源性非编码小分子RNA，在心肌肥厚、心律失常、冠心病等心血管疾病的发生发展中发挥重要作用［6-7］。miR-328 广泛存在于全身各组织，其在肥厚心肌组织中呈高表达，并参与了心肌肥厚的发展［8］。ZHAO 等［9］研究显示，心肌细胞来源的miR-328 通过旁分泌调节邻近成纤维细胞，从而促进心肌纤维化的发生。LU 等［10］研究发现，miR-328 在心房颤动患者中高表达，参与影响心房电重构，从而诱导房颤的发生。以上研究表明，miR-328 在多种心血管疾病中表达升高，并参与了心血管疾病的发生发展。本研究结果显示，MI小鼠梗死心肌组织中的miR-328 高表达，且上调 miR-328 表达后 MI 小鼠的心肌梗死面积显著增加，心功能进一步恶化；而抑制miR-328表达后，MI小鼠心肌梗死面积减小，心功能明显好转；提示miR-328 可加重MI 小鼠的心肌损伤，并降低其心功能。

目前，miR-328 通过何种机制对MI 小鼠的心脏功能产生影响尚不清楚，可能为多因素联合机制［11-12］。L型钙离子通道是电压依赖性的钙通道，由α1、β、α2/δ 亚基组成，L 型钙离子通道激活时，大量钙离子快速内流形成L 型钙离子电流（ICaL），参与快速去极化，特别在心肌兴奋—收缩偶联及其他电生理活动中具有重要作用［13-14］。近年来，L型钙离子通道因其参与心肌细胞肥厚［15］、心律失常［16-17］等心脏疾病而受到广泛关注。BOSCH 等［18］研究发现，在家兔快速心房起搏模型中CaV2 表达与ICaL同步减少，且均早于α1c亚基mRNA 表达改变。张朝等［19］认为，CaV2 表达降低导致功能性L 型钙离子通道减少。另有研究表明，房颤时CaV2 作为miR-328 的mRNA靶点而被抑制，导致心房肌细胞ICaL下降，心肌收缩能力减弱［10］。本研究结果显示，MI小鼠梗死心肌组织miR-328 表达增加的同时，CaV2 mRNA 及蛋白相对表达量均下降；上调miR-328 表达则CaV2 mRNA及蛋白相对表达量进一步下降，小鼠心功能进一步恶化；抑制miR-328 表达则CaV2 mRNA 及蛋白相对表达量上升，小鼠心功能改善；此外，相关性分析结果提示心肌梗死组织miR-328 与CaV2 mRNA 表达呈显著负相关关系。以上结果提示，miR-328 可能通过转录后抑制CaV2 mRNA 表达，从而减少CaV2蛋白合成，导致心功能降低；反之，CaV2蛋白合成增加、心功能改善。因此，我们推测miR-328 调控MI小鼠心功能的作用机制可能与转录后调节CaV2 表达，引起L型钙离子通道数量变化，进而影响心肌收缩功能有关。

综上所述，MI 小鼠梗死心肌组织miR-328 表达升高，miR-328可加重MI小鼠心肌损伤、导致心功能降低，其机制可能与负性调控CaV2 表达有关；提示miR-328 可能是MI 治疗的有效靶点，可为临床保护缺血心肌提供了新思路。