miR-200c对人绒毛膜滋养细胞迁移、侵袭、EMT的影响及其分子机制

郝媛媛，徐曼，安泓润

河北中石油中心医院产科，河北廊坊065000

绒毛膜滋养细胞是胎盘最主要的组成细胞之一，也是维持胎盘正常功能的最重要的功能细胞，目前普遍认为人绒毛膜滋养细胞的迁移、侵袭功能障碍可能引发子痫前期（PE）的发生［1］。上皮—间质转化（EMT）是上皮细胞转化成间质细胞的过程，细胞转化后极性和黏附功能丢失，但获得了较高的侵袭及迁移能力。目前研究已经证实，人绒毛膜滋养细胞的迁移、侵袭功能障碍与其EMT 过程受损有关［2-3］。miR-200c 是近年来发现的与 EMT 调控有关的miRNAs 家族成员之一，其在PE 大鼠胎盘组织和PE 患者的血清中表达均明显升高，但其异常升高是否影响绒毛膜滋养细胞迁移、侵袭及EMT 尚不明确［4-5］。2021 年 1 月—4 月，本研究观察了 miR-200c表达对人绒毛膜滋养细胞迁移、侵袭及EMT 的影响，并探讨其可能的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：人绒毛膜滋养细胞HTR8/Svneo购自美国ATCC 公司，用含10%胎牛血清的RPMI 1640 细胞培养基，置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中进行培养。主要试剂：TRIzol 试剂、LipofectamineTM2000 脂质体转染试剂均购自美国Invitrogen 公司，8.0 μm 孔径 Transwell 小室购自美国 Corning 公司，Mgtrigel 基质胶购自美国BD 公司；逆转录试剂盒、实时荧光定量检测试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司，miR-200c和内参U6引物均购自广州锐博生物技术有限公司；miR-200c 模拟物（miR-200c mimics）、miR-200c 抑制物（miR-200c inhibitor）、miRNA 阴性对照（miR-NC）、Notch1 野生型（WT）和突变型（MUT）荧光素酶报告基因质粒载体均购自上海吉玛制药技术有限公司；一抗Notch1、N-cadherin、Fibronectin、E-cadherin、GAPDH 抗体均购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记的二抗IgG均购自武汉博士德公司。

1.2 细胞分组及处理 将对数生长期的HTR8/Svneo 细胞，以 1×105/mL 接种至 6 孔板中，培养 24 h，将细胞分为过表达组、沉默组和对照组，三组按照脂质体转染试剂LipofectamineTM2000 说明书步骤操作，分别转染 miR-200c mimics、miR-200c inhibitor、miR-NC。

1.3 细胞miR-200c 表达检测 采用实时荧光定量PCR 法。三组转染24 h，采用TRIzol 法提取细胞总RNA，应用逆转录试剂盒将RNA 逆转录成cDNA。加入引物，以cDNA 为模板，应用实时荧光定量试剂盒进行扩增反应。PCR 引物序列：miR-200c 上游引物5′-GCCCGCTAATACTGCCGGGTAAT-3′、下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，内参U6 上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR 反应过程：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，共40个循环。以U6作为内参，采用2－ΔΔCt法计算miR-200c相对表达量。

1.4 细胞迁移能力观察 采用细胞划痕实验。收集三组转染后培养24 h 的细胞，用无血清培养基制备细胞悬液，以 1×105/mL 接种至 6 孔板，继续培养细胞铺满整个细胞板孔面，使用无菌加样枪头（规格200 μL）垂直于细胞板作一直线划痕，PBS 冲洗，加入无血清细胞培养基继续培养24 h。各组分别在划痕后0、24 h 于显微镜下观察细胞划痕间距，计算细胞迁移率，细胞迁移率（%）=（0 h 划痕间距-24 h 划痕间距）/0 h划痕间距×100%。

1.5 细胞侵袭能力观察 采用Transwell 侵袭实验。收集三组转染后培养24 h 的细胞，用无血清培养基制备细胞悬液，并将细胞密度调整为1×105/mL。取Transwell 小室，用预冷的无血清细胞培养基稀释Mgtrigel 基质胶，将其对小室底膜上室面进行预铺胶。取0.3 mL 细胞悬液接种至小室上室，将含10%胎牛血清的细胞培养基加入小室下室，在37 ℃培养箱中继续培养24 h。取出小室，擦掉小室膜上表面的残留细胞，4%甲醛固定小室膜下表面的穿膜细胞。结晶紫溶液染色30 min，光学显微镜下计数穿膜细胞数，以此表示细胞侵袭能力。

1.6 细 胞 E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin 及Notch1 蛋白表达检测 采用Western blotting 法。收集三组转染后培养24 h 的细胞，细胞总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，取30 μg 蛋白样品上样，4%浓缩胶和12%分离胶行SDS-PAGE 电泳；将蛋白质电转至PVDF 膜上，置入含50 g/L 脱脂奶粉的封闭液中封闭2 h。分别加入一抗E-cadherin（稀释比1∶1 000）、N-cadherin（稀释比 1∶2 000）、Fibronectin（稀释比1∶2 000）、Notch1（稀释比1∶1 000）和GAPDH（稀释比1∶10 000），4 ℃孵育过夜；TBST 洗膜后加入二抗IgG（稀释比1∶10 000），室温孵育2 h。加入ECL 发光试剂在暗室发光显影，成像系统拍照后分析各条带灰度值。以GAPDH 作内参，计算E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin 及 Notch1 蛋白相对表达量。

1.7 miR-200c 与Notch1 的靶向关系验证 采用双荧光素酶报告基因实验。将HTR8/Svneo 细胞以1×105/mL 接种于96 孔细胞板上，分为四部分，采用脂质体转染试剂LipofectamineTM2000 分别共转染Notch1-WT、Notch1-MUT 与 miR-200c mimics、miRNC。转染24 h 后收集细胞，使用荧光素酶检测试剂盒检测细胞的荧光素酶活性，计算相对荧光素酶活性。

1.8 统计学方法 采用SPSS21.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用SNK-q法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞miR-200c 相对表达量比较 过表达组、沉默组及对照组细胞miR-200c 相对表达量分别为2.36±0.21、0.53±0.14、1.06±0.08，组间两两比较P均＜0.05。

2.2 各组细胞迁移率比较 过表达组、沉默组及对照组细胞迁移率分别为16.2% ± 2.1%、81.2% ±4.6%、51.1%±3.8%，组间两两比较P均＜0.05。见OSID码图1。

2.3 各组细胞侵袭穿膜细胞数比较 过表达组、沉默组及对照组穿膜细胞数分别为（45 ± 11）、（310 ±29）、（181 ± 20）个，组间两两比较P均＜0.05。见OSID码图2。

2.4 各组细胞EMT 相关蛋白及Notch1 蛋白表达比较 过表达组、对照组、沉默组E-cadherin 蛋白相对表达量依次降低，N-cadherin、Fibronectin 和 Notch1蛋白相对表达量依次升高，组间两两比较P均＜0.05。见表1、OSID码图3。

表1 各组细胞EMT相关蛋白及Notch1蛋白相对表达量比较（）

表1 各组细胞EMT相关蛋白及Notch1蛋白相对表达量比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与过表达组比较，#P＜0.05。

组别过表达组沉默组对照组Notch1 0.20±0.09*1.29 ±0.16*#0.76±0.14 E-cadherin 1.29±0.13*0.33 ±0.11*#0.69±0.15 N-cadherin 0.42±0.13*1.52 ±0.18*#1.02±0.11 Fibronectin 0.26±0.07*1.09 ±0.09*#0.73±0.12

2.5 miR-200c 与Notch1 的靶向关系验证结果 转染Notch1-WT 和miR-200c mimics 的细胞相对荧光素酶活性为0.31±0.09，转染Notch1-WT和miR-NC的细胞为 0.99 ± 0.03（P＜0.05）；转染 Notch1-MUT和miR-200c mimics 的细胞相对荧光素酶活性为1.00 ± 0.05，转染 Notch1-MUT 和 miR-NC 的细胞为1.02 ± 0.04（P＞0.05）。

3 讨论

miRNAs 是一类长度为20～22 个核苷酸的非编码小分子RNA，能够调控靶基因翻译或转录，参与机体细胞的生理病理活动及许多疾病的发生发展。PE患者血清和胎盘组织均发现有多种miRNAs表达异常，这些异常表达的miRNAs可能造成绒毛膜滋养细胞功能的异常［6］。REN 等［7］发现，过表达 miR-375能够抑制PE 大鼠绒毛膜滋养细胞的侵袭和增殖。YANG 等［8］发现，PE 患者血浆 miR-215-5p 表达明显升高，并且与绒毛膜滋养细胞迁移、侵袭功能降低有关。在PE 血浆和胎盘组织中，miR-141-3p 和miR-200a-3p表达均升高，并且可能与绒毛膜滋养细胞的功能异常有关［9］。miR-200c 是 miR-200 家族成员之一，近期研究发现其在PE 大鼠胎盘组织和PE 患者血清中的表达均明显升高，但其异常升高是否影响绒毛膜滋养细胞迁移、侵袭尚不清楚［4-5］。本研究结果显示，过表达miR-200c 的绒毛膜滋养细胞迁移和侵袭能力明显下降，而沉默miR-200c 的绒毛膜滋养细胞迁移和侵袭能力明显升高，提示miR-200c 能够影响绒毛膜滋养细胞的迁移和侵袭能力。

EMT 是机体细胞的一个重要生理过程，通过这个过程，极化的上皮细胞具有了间充质表型，其中包括迁移和侵袭能力，这对于细胞的发育和功能维持至关重要。目前研究认为，滋养细胞EMT 受损与其迁移、侵袭功能受限有关，可能是PE 发病的重要机制，也为PE 的治疗提供了新的研究方向［10-11］。已有研究证实，miR-200c 与EMT 密切相关，但其对人绒毛膜滋养细胞迁移和侵袭能力的影响是否与EMT调控有关尚不清楚。本研究结果显示，过表达miR-200c 的人绒毛膜滋养细胞上皮源性标志物E-cadherin 蛋白表达升高，间质源性标志物N-cadherin和Fibronectin蛋白表达降低；反之，沉默miR-200c的人绒毛膜滋养细胞上皮源性标志物E-cadherin 蛋白表达降低，间质源性标志物N-cadherin 和Fibronectin蛋白表达升高；提示miR-200c 过表达可导致滋养细胞EMT障碍，从而降低了细胞的迁移、侵袭能力。

Notch 信号通路是调控EMT 的重要信号通路之一，也是着床和胎盘形成过程中发挥重要作用的信号通路之一［12］。Notch1 是 Notch 信号通路的主要受体之一，其在PE胎盘组织和人绒毛膜滋养细胞中表达均降低，而Notch1 表达降低可能会影响滋养细胞的 EMT，从而影响其迁移、侵袭能力［13-15］。研究发现，在许多生理或病理过程中，miR-200c 均可通过靶向调控Notch1 而发挥作用［16-17］。本研究双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-200c 与Notch1 存在靶向关系，并且过表达miR-200c 的滋养细胞Notch1蛋白表达下降，而沉默miR-200c 的滋养细胞Notch1蛋白表达升高，提示miR-200c 可负性调控Notch1表达。

综上所述，miR-200c 能够抑制人绒毛膜滋养细胞的迁移、侵袭及EMT，从而参与了PE的发病，其机制可能与靶向调控Notch1有关，为PE的靶向治疗提供了新的研究方向。