二甲双胍对抑郁症大鼠抑郁样行为的影响及其分子机制

丁昊，房慧，李志刚

1 淄博市精神卫生中心精神科，山东淄博255100；2 淄博市精神卫生中心心理咨询与治疗中心；3 菏泽市中医医院脑病科

抑郁症是以显著而持久的情绪低落为主要特征的精神障碍性疾病，具有较高的致残率、复发率及自杀率，其发病机制不明确，且尚无特效的治愈方法［1-2］。近来研究发现，抑郁症患者的记忆及情感控制能力降低，可能与海马损伤及体积缩小有关，且抑郁症模型动物海马神经元中存在大量自噬，并认为自噬介导的细胞凋亡增强可能是引起抑郁症患者海马损伤的主要原因［3］。磷脂酰肌醇（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路活化可调控细胞增殖、分化及凋亡，且PI3K/Akt活化可调控下游雷帕霉素靶蛋白mTOR活化，参与调控细胞自噬，被认为是促进细胞存活、抑制自噬的关键通路［4］。研究显示，PI3K/Akt/mTOR 通路介导的细胞凋亡及自噬反应可能参与了抑郁症海马神经元凋亡过程［5］。二甲双胍是一种降糖药，近来发现其也具有抗衰老及神经保护作用［6］。已有研究显示，二甲双胍可改善抑郁症大鼠抑郁样行为［7］。但二甲双胍改善抑郁大鼠抑郁样行为的具体机制是否与PI3K/Akt/mTOR 通路介导的细胞凋亡及自噬有关尚未可知，为此我们于2019 年6 月—2020年12月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：清洁级雄性SD 大鼠60 只，6～8周龄，体质量200～220 g，购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司，生产许可证号SCXK（京）2020-0007。主要试剂：二甲双胍购自中美上海施贵宝制药有限公司；PI3K/Akt 抑制剂NVP-BEZ235 购自爱必信上海生物科技有限公司，雷帕霉素购自上海宝曼生物科技有限公司；TUNEL 染色试剂盒购自北京伊塔生物科技有限公司，LC3B（ab192890）、PI3K（ab154598）、磷酸化 PI3K（p-PI3K，ab182651）、Akt（ab8805）、磷 酸 化 Akt（p-Akt，ab38449）、mTOR（ab134903）、磷酸化mTOR（p-mTOR，ab45996）、自噬相关蛋白Beclin1（ab210498）、抗凋亡蛋白Bcl2（ab203516）、Atg13（ab201467）等兔抗大鼠抗体均购自美国Abcam公司。

1.2 抑郁症大鼠模型建立及分组处理 取50 只SD 大鼠，均给予慢性不可预见性应激压力刺激建立抑郁症大鼠模型［7］，并随机分为模型组、二甲双胍组、PI3K/Akt 抑制剂组、二甲双胍+抑制剂组、雷帕霉素组，每组10 只。另取10 只SD 大鼠作为正常对照组。二甲双胍组参照文献［7］设置二甲双胍剂量100 mg/kg，并按10 mg/mL（生理盐水溶解成混悬液）、10 mL/kg 的剂量进行腹腔注射，1 次/天，连续14 d；PI3K/Akt 抑制剂组参照文献［8］经腹腔注射PI3K/Akt 抑 制 剂 NVP-BEZ235 22.5 mg/kg，3 天/次，共4 次；雷帕霉素组参照文献［8］灌胃给予雷帕霉素2 mg/kg，1 次/天，连续14 d；二甲双胍+抑制剂组参照上法同时腹腔注射二甲双胍和NVP-BEZ235；模型组及正常对照组腹腔注射10 mL/kg 生理盐水，连续14 d。

1.3 大鼠行为变化评估

1.3.1 一般行为 各组大鼠给药结束后，记录饮食、精神、活动等一般行为变化。

1.3.2 抑郁样行为 各组大鼠给药结束后，进行蔗糖水消耗实验、旷场实验、强迫游泳和悬尾不动实验，分别记录糖水偏爱率、旷场中央运动距离、强迫游泳不动时间、悬尾不动时间。各实验均参照文献［7］方法进行操作。

1.4 大鼠海马组织神经元结构及自噬现象观察 采用透射电镜观察。各组大鼠行为观察结束后进行麻醉，尾静脉空气栓塞法处死，取完整海马组织，剪取1 cm×1 cm 组织块送电镜室处理，观察海马神经元结构及自噬体、溶酶体形成情况，并进行拍照。将剩余海马组织分成两部分，一部分置于－80 ℃冰箱内保存备用；另一部分置于4%多聚甲醛中固定24 h，浸蜡、包埋后进行5 μm厚度切片。

1.5 大鼠海马组织神经元凋亡情况观察 采用TUNEL 染色法。取各组大鼠相同部位海马组织石蜡切片，按TUNEL 染色液说明书方法染色后，于显微镜下观察并随机取5 个视野，凋亡神经元阳性染色为红棕色，采用Image-Pro Plus 6.0 软件记录凋亡神经元数及总细胞数。神经元凋亡率（%）=凋亡神经元数/总细胞数×100%。

1.6 大鼠海马组织LC3B、p-mTOR表达检测 采用免疫组化法。取各组大鼠相同部位海马组织石蜡切片，二甲苯脱蜡及梯度乙醇脱水后，4 ℃孵育盒中滴加LC3B、p-mTOR 一抗（1∶200）孵育过夜，滴加IgG二抗室温孵育30 min。DAB显色、封片后，光镜下观察拍照，每个切片随机取5 个视野。采用Image-Pro Plus 6.0 软件分析每个视野下阳性染色（棕黄色）的平均光密度（OD）值，以此表示LC3B、p-mTOR 阳性表达水平。

1.7 大鼠海马组织PI3K/Akt/mTOR 通路及下游相关蛋白表达检测 采用Western blotting 法。取各组大鼠冰冻海马组织，4 ℃解冻，粉碎及匀浆处理后，提取总蛋白。BCA 法检测蛋白浓度，取100 μg 蛋白样品行电泳、转膜反应，4 ℃孵育盒中滴 加 PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Atg13、Bcl2、Beclin1 一抗（1∶1 500）及内参 β-actin抗体（1∶2 000）孵育过夜，次日滴加HRP 山羊抗兔二抗（1∶2 000）继续孵育2 min。增强化学发光法显影曝光后，Image J 软件分析并计算目的条带相对灰度值。

1.8 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，组间和组内比较分别采用成组t检验和配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般行为比较 正常对照组大鼠饮食及活动正常；模型组大鼠精神萎靡，活动减少、食欲减退、眼睛无神等明显；二甲双胍组大鼠食欲及活动增加，精神萎靡及眼睛无神较模型组减轻。PI3K/Akt 抑制剂组及雷帕霉素组大鼠上述症状较模型组进一步加重，二甲双胍+抑制剂组大鼠上述症状与模型组相近。

2.2 各组大鼠抑郁样行为相关指标比较 见表1。

表1 各组大鼠糖水偏爱率、旷场中央运动距离、强迫游泳不动时间、悬尾不动时间比较（）

表1 各组大鼠糖水偏爱率、旷场中央运动距离、强迫游泳不动时间、悬尾不动时间比较（）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组及二甲双胍+抑制剂组比较，#P＜0.05；与二甲双胍组比较，△P＜0.05。

组别正常对照组模型组二甲双胍组PI3K/Akt抑制剂组雷帕霉素组二甲双胍+抑制剂组悬尾不动时间（s）97.02±6.11 143.39±9.53*88.93±7.15#179.22±8.44*#△181.36±8.09*#△149.38±6.20*n 10 10 10 10 10 10糖水偏爱率（%）66.85±5.11 49.21±3.46*65.25±5.22#26.27±2.62*#△25.56±2.40*#△48.81±3.49*旷场中央运动距离（m）4.00±0.39 2.39±0.21*4.03±0.35#1.28±0.14*#△1.30±0.19*#△2.30±0.20*强迫游泳不动时间（s）4.00±0.44 26.39±2.11*5.53±0.55#40.22±4.24*#△41.36±4.09*#△24.38±2.20*

2.3 各组大鼠海马神经元结构及自噬现象比较 正常对照组大鼠海马神经元结构正常、完整，核质均匀，细胞器清晰。模型组大鼠海马神经元细胞核膜局部断裂且模糊不清，核内染色质边缘聚集，细胞质中可见明显的自噬体及自噬溶酶体。二甲双胍组大鼠海马神经元核膜局部断裂减轻，细胞质空泡化、自噬体及自噬溶酶体形成均减少；PI3K/Akt 抑制剂组及雷帕霉素组大鼠海马神经元结构损伤及自噬现象较模型组加重，二甲双胍+抑制剂组大鼠海马神经元结构损伤及自噬现象与模型组相近。见OSID码图1。

2.4 各组大鼠海马组织神经元凋亡率比较 正常对照组、模型组、二甲双胍组、PI3K/Akt 抑制剂组、雷帕霉素组、二甲双胍+抑制剂组大鼠海马组织神经元凋亡率分别为 3.16% ± 0.29%、26.08% ±2.84%、6.05% ± 0.59%、39.08% ± 3.11%、38.75%± 3.02%、25.89% ± 2.80%；与正常对照组比较，模型组大鼠海马组织神经元凋亡率升高（P＜0.05）；与模型组比较，二甲双胍组大鼠海马组织神经元凋亡率降低（P＜0.05），PI3K/Akt抑制剂组及雷帕霉素组均升高（P均＜0.05），二甲双胍+抑制剂组无明显变化（P＞0.05）。见OSID码图2。

2.5 各组大鼠海马组织LC3B、p-mTOR 表达比较见表2和见OSID码图3、4。

表2 各组大鼠海马组织LC3B、p-mTOR表达比较（）

表2 各组大鼠海马组织LC3B、p-mTOR表达比较（）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组及二甲双胍+抑制剂组比较，#P＜0.05；与二甲双胍组比较，△P＜0.05。

p-mTOR 1.04±0.02 0.37±0.03*0.89±0.05#0.18±0.02*#△0.15±0.02*#△0.40±0.03*组别正常对照组模型组二甲双胍组PI3K/Akt抑制剂组雷帕霉素组二甲双胍+抑制剂组n 10 10 10 10 10 10 LC3B 0.22±0.06 1.09±0.16*0.55±0.05#1.81±0.18*#△1.86±0.17*#△1.11±0.11*

2.6 各组大鼠海马组织PI3K/Akt-mTOR 通路及下游相关蛋白表达比较 见表3和OSID码图5、6。

表3 各组大鼠海马组织PI3K/Akt-mTOR通路及下游相关蛋白表达比较（）

表3 各组大鼠海马组织PI3K/Akt-mTOR通路及下游相关蛋白表达比较（）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组及二甲双胍+抑制剂组比较，#P＜0.05；与二甲双胍组比较，△P＜0.05。

组别正常对照组模型组二甲双胍组PI3K/Akt抑制剂组雷帕霉素组二甲双胍+抑制剂组Bcl2 1.12±0.09 0.69±0.05*0.96±0.09#0.17±0.01*#△0.20±0.02*#△0.61±0.06*n 10 10 10 10 10 10 p-PI3K/PI3K 1.01±0.10 0.39±0.03*0.91±0.09#0.19±0.11*#△0.02±0.02*#△0.40±0.04*p-Akt/Akt 1.07±0.11 0.48±0.04*0.99±0.09#0.20±0.02*#△0.23±0.03*#△0.50±0.05*p-mTOR/mTOR 1.12±0.09 0.59±0.05*1.06±0.11#0.15±0.01*#△0.10±0.01*#△0.57±0.06*Beclin1 1.01±0.10 1.99±0.19*1.21±0.11#2.59±0.21*#△2.52±0.22*#△1.90±0.19*Atg13 1.07±0.11 1.88±0.18*1.29±0.11#2.30±0.22*#△2.33±0.23*#△1.80±0.18*

3 讨论

情感淡漠、思维迟钝、兴趣丧失、悲观绝望、动作迟缓、自杀自残等是抑郁症最主要的心理及躯体症状［10］。慢性不可预见性应激压力刺激是诱导模拟人类抑郁样行为的重要方法［11］。本研究建立大鼠模型后发现，抑郁症大鼠精神萎靡、活动减少、食欲减退、眼睛无神等症状明显，糖水偏好实验、强迫游泳和悬尾不动实验、旷场实验发现大鼠出现快感缺失（糖水偏爱率降低）、绝望行为增加、自发活动减少、兴趣及活动能力降低等类似人类抑郁症的行为，提示大鼠造模成功。抑郁症发病机制复杂，海马神经元结构及功能损伤是导致抑郁症患者情绪、学习记忆及行为调节失常的重要原因。LAROY等［12］研究发现，抑郁症会造成海马损伤及体积缩小，从而导致海马负责的情感及功能受损；LIU等［13］发现，抑郁症患者海马神经元出现结构破坏及数量减少现象。本研究也在抑郁症模型大鼠海马组织中检测到神经元细胞核内染色质增多、核膜增厚、核仁移位，核周间隙扩大及细胞器较少等结构损伤现象，且海马神经元凋亡率明显高于正常对照组大鼠，提示海马神经元凋亡与大鼠抑郁症关系密切。二甲双胍除降糖外，还具有神经保护作用。FATEMI等［14］发现，另外，二甲双胍可通过抑制神经元凋亡及应激性损伤，上调神经营养因子（BDNF）表达，来发挥抗癫痫及神经保护作用。二甲双胍也对焦虑、抑郁、认知障碍等神经精神疾病有缓解作用。HUSSEIN等［15］发现，二甲双胍可改善高脂饮食大鼠抑郁样症状和认知障碍。本研究结果显示，给予大鼠二甲双胍干预治疗后，大鼠抑郁样行为减少，同时海马神经元损伤及凋亡明显减少，提示二甲双胍可能成为治疗抑郁症的潜在药物。

自噬可消化和清除受损的细胞器、蛋白质，给细胞生存提供相对稳定及适宜的内环境，但自噬也是一种程序性死亡方式，可作为死亡机制诱导细胞发生程序性死亡，而参与神经系统疾病的发生发展［16］。自噬被适度激活可保护细胞免于凋亡和坏死，但严重刺激时，自噬过度激活可引发细胞程序性死亡。自噬也与抑郁症患者神经元凋亡关系密切。张胜等［17］研究发现，抑郁症大鼠海马神经元中存在自噬过度激活现象，并认为抑郁症海马神经元凋亡及海马体积萎缩可能与细胞自噬过度激活有关。本研究发现，模型组大鼠海马神经元损伤及凋亡的同时，海马神经元细胞自噬溶酶体增多，且自噬标记蛋白LC3B 在神经元细胞质中的表达升高，提示抑郁症大鼠海马神经元存在明显的细胞自噬。

mTOR 是自噬发生的抑制性激酶，其激活后可磷酸化Atg13，使其与Atg13 的结合能力下降，进而抑制自噬［18］。雷帕霉素为mTOR 的抑制剂，本研究用雷帕霉素抑制mTOR活化、促进自噬来干预治疗抑郁症后发现，大鼠海马神经元中p-mTOR 降低，自噬及自噬标记蛋白LC3B、Beclin1表达进一步升高的同时，大鼠抑郁样行为及神经元凋亡损伤均进一步加重，证实神经元过度自噬，可能是抑郁症大鼠抑郁行为及神经元损伤凋亡加重的相关机制。PI3K/Akt为mTOR的上游调控因子，其不仅是细胞存活的关键通路，且活化后可正向调控mTOR 活性，介导自噬的产生。MA 等［19］发现，Akt 磷酸化水平升高可磷酸化Bcl2 家族凋亡促进因子，从而抑制凋亡途径的起始过程，发挥促细胞生存作用。蔡萧君等［20］发现，抑郁症模型大鼠海马神经元中存在PI3K/Akt/mTOR 活性水平降低，并认为PI3K/Akt/mTOR 活化水平降低，其介导的自噬及凋亡激活，可能是引起抑郁症大鼠抑郁行为及海马神经元损伤凋亡发生的关键机制。本研究在模型组大鼠海马神经元中检测到PI3K/Akt磷酸化水平及p-mTOR水平降低，以及自噬活性升高，而抑制PI3K/Akt通路活化后大鼠海马神经元自噬、凋亡进一步升高，其抑郁样行为进一步加重；证实PI3K/Akt通路活化水平被抑制，可加重抑郁症大鼠抑郁样行为。二甲双胍组大鼠海马组织中PI3K/Akt/mTOR 磷酸化水平处于激活状态，提示二甲双胍改善抑郁症大鼠抑郁行为及海马神经元损伤凋亡作用，可能与促进PI3K/Akt/mTOR 磷酸化激活、抑制海马神经元自噬及凋亡有关。二甲双胍与PI3K/Akt通路抑制剂联合应用后，大鼠抑郁行为、海马神经元自噬及凋亡反应均明显高于单独应用二甲双胍组，证实阻断PI3K/Akt通路可削弱二甲双胍对抑郁症的改善作用。

综上所述，二甲双胍可减轻抑郁症大鼠抑郁样行为，其机制可能与促进PI3K/Akt/mTOR 通路磷酸化激活、抑制海马神经元自噬及凋亡有关。这为阐明二甲双胍在抗抑郁症方面的研究应用提供一定依据，但抑郁症海马神经元损伤及凋亡机制复杂，可能涉及代谢、应激等多方面机制，二甲双胍治疗抑郁症的其他机制还需进一步探究。