H2O2-VC降解对香水莲花多糖结构与活性的影响

谭诗敏，罗志刚，程建华

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510640；2.华南理工大学环境与能源学院，广东 广州 510640）

香水莲花（Nymphaea hybrid）是睡莲属的大型睡莲，在广东、福建、云南、广西、浙江等地都有种植基地。有黄、白、红、蓝等9种颜色，故又名“九品莲花”。香水莲花含有多糖、蛋白质、酚类、黄酮、生物碱、鞣质、纤维素等成分[1]。研究表明，香水莲花多糖（N.hybridpolysaccharides，NHP），有良好的抗氧化、保湿活性[2-3]。前期实验制备的NHP分子质量较大；由于高分子质量多糖具有黏度大、溶解性差，生物利用度低等缺点[4-5]。对NHP进行适度降解，有望在食品、化妆品、医药等领域得到更广泛的应用[6-7]。

H2O2氧化法是近年来应用较多的多糖降解方法，利用H2O2分解产生的羟自由基氧化断裂多糖间糖苷键，该方法绿色环保且可控性强[8]。但由H2O2自发产生羟自由基进行多糖降解过程缓慢，当体系中同时加入H2O2和VC，H2O2能够氧化VC，快速生成2,3-二酮古洛糖酸和羟自由基，与单一H2O2体系相比，低浓度VC的加入显著增加了自由基的数量，多糖的降解速率明显提高[9-10]。Zhang Zhongshan等[11]发现低浓度H2O2-VC能够在短时间内降低莲子多糖黏度，提高多糖抗氧化活性，该反应对多糖的主要官能团结构无明显改变[12]。目前，关于降解NHP的方法及其产物性质的相关研究鲜有报道，因此，本研究采用H2O2-VC体系降解多糖，系统研究降解对多糖分子质量、结构、流变性和其他功能特性的影响，以期为香水莲花的开发利用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄色香水莲花产于广东珠海；无水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、30% H2O2（均为分析纯） 广州化学试剂厂；抗坏血酸、氢氧化钠、三氟乙酸、刚果红、溴化钾、大豆卵磷脂、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、铁氰化钾、硫酸亚铁、水杨酸、三氯化铁（均为分析纯），磷酸二氢钾（色谱纯） 美国阿拉丁公司；玉米油 益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司。

1.2 仪器与设备

JY92-IIN超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；Nicolet 5700傅里叶红外光谱仪、IC5000离子色谱仪 美国Thermo Fisher公司；2695高效液相色谱仪美国Waters公司；DE 19720旋转流变仪 美国TA公司；U2910紫外-可见分光光度计 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 NHP的制备

黄色香水莲花粉末以料液比1∶5（g/mL）在95%乙醇溶液中80 ℃加热回流3 h，脱色，除去脂溶性成分，抽滤后烘干滤渣。然后，采用超声细胞粉碎机辅助提取，称取一定量已脱色的香水莲花粉末，按料液比1∶30（g/mL）加入去离子水，650 W处理30 min（开5 min，关1 min）；随后，80 ℃水浴搅拌提取3 h，离心得上清液并旋蒸至原体积的1/5。加入Sevag试剂（氯仿-正丁醇，1∶4（V/V））脱蛋白5 次，旋蒸除去残留的有机试剂。最后，加入AB-8大孔树脂，室温磁力搅拌5 h脱色，抽滤得滤液；缓慢向滤液中加入4 倍95%乙醇溶液，4 ℃静置12 h，沉淀真空干燥，得NHP。

1.3.2 香水莲花降解多糖的制备

采用H2O2-VC对NHP溶液进行可控降解，参照Li Junhui等[10]方法并稍作修改。根据前期已探究的最佳工艺参数进行降解，配制100 mmol/L H2O2、 5 mg/mL多糖溶液20 mL，加入20 mmol/L VC，60 ℃降解30、60、90 min。降解后调pH值至中性，去离子水透析48 h（3 500 Da），减压蒸馏浓缩后冻干，得到3种降解多糖DNHP-1、DNHP-2、DNHP-3。

1.3.3 分子质量测定

采用凝胶渗透色谱测定NHP及3种降解多糖的分子质量[13]。色谱条件：Ultrahydrogel 120、250、500色谱柱串联（7.8 mm×300 mm），柱温为35 ℃；2414示差检测器；流动相为0.02 mol/L KH2PO4溶液（pH 6），流速0.8 mL/min；进样量20 μL。用流动相配制不同分子质量葡聚糖标准溶液（2 mg/mL），测定保留时间，根据分子质量对数值与保留时间拟合得标准曲线。在相同条件下，测定多糖的出峰时间，通过标准曲线计算分子质量。

1.3.4 单糖组成测定

通过离子色谱测定NHP及3种降解多糖的单糖和糖醛酸组成[14]。称取5 mg多糖于安瓿瓶中，加入2 mol/L三氟乙酸溶液10 mL，120 ℃水解3 h，用氮气吹干仪吹干溶剂，加入5 mL水溶解，离心后取上清液进离子色谱分析。色谱条件：DionexCarbopacTMPA20色谱柱（3 mm×150 mm），柱温为30 ℃；电化学检测器；流动相：A为H2O，B为250 mmol/L NaOH溶液，C为50 mmol/L NaOH和500 mmol/L NaOAc溶液，流速为0.3 mL/min；进样量5 μL。

1.3.5 红外光谱扫描

通过傅里叶红外光谱扫描，分析NHP及3种降解多糖的结构。多糖和KBr充分研磨后压片，在4 000～500 cm－1波数内扫描，得到红外光谱。

1.3.6 刚果红实验

参考Chen Xiaoyong等[15]的方法，稍作修改。将多糖溶液（1 mg/mL）和刚果红溶液（100 μmol/L）等体积混合，加入不同浓度的NaOH溶液，使溶液浓度在0～0.5 mol/L内，在波长700～400 nm范围内紫外扫描，测定溶液的最大吸收波长。用去离子水代替多糖溶液作空白对照组，具有三股螺旋结构的凝胶多糖作阳性对照。

1.3.7 流变学特性测定

参考Yuan Dan等[16]的方法，配制20 mg/mL的多糖溶液，通过流变仪测定NHP及3种降解多糖的流变特性。测试间隙为1 mm，采用25 mm直径的探头。剪切速率扫描范围为0.1～100 s－1，温度为25 ℃，测定表观黏度；恒定1 Hz频率，角频率扫描范围为0.1～100 rad/s，温度为25 ℃，测定储能模量（G’）和损耗模量（G’’）。

1.3.8 功能特性测定

1.3.8.1 持水性和持油性

参考Jeddou等[17]的方法。多糖分别用去离子水、玉米油配制成1 g/100 mL，测定NHP及3种降解多糖的持水性、持油性。

1.3.8.2 乳化活性和乳化稳定性

参考Pearce等[18]的方法，稍作修改。以大豆卵磷脂作阳性对照，多糖配制成0.1 g/100 mL溶液，6 mL多糖溶液与3 mL玉米油混合，10 000 r/min均质2 min，分别在0、10 min取50 μL乳液与5 mL的0.1 g/100 mL的SDS溶液混合，在波长500 nm处测定吸光度，计算得乳化活性和乳化稳定性。

1.3.9 抗氧化活性测定

DPPH自由基、羟自由基清除率测定参考冯燕如[13]的方法，2,2’-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（2,2’-amino-di (3-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt，ABTS）阳离子自由基清除率测定参考Xiao Heng等[19]的方法，VC作阳性对照，测定不同浓度NHP及3种降解多糖的自由基清除率。

1.4 数据处理与分析

应用Excel 2019数据处理及分析，Origin 2018 64bit绘图，IBM SPSS Statistics 25进行单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 H2O2-VC降解对多糖分子质量的影响

在降解时间为0、30、60、90 min时测定多糖的分子质量。如图1所示，随着降解时间的延长，色谱峰明显向右偏移，说明H2O2-VC降解使多糖的分子质量显著下降。由表1可知，未降解多糖NHP分子质量为1 122 kDa，降解多糖DNHP-1、DNHP-2、DNHP-3分子质量分别为129、46、15 kDa。

图1 NHP和DNHP的凝胶渗透色谱图Fig.1 Gel permeation chromatographic (GPC) profiles of NHP and DNHP

表1 NHP和DNHP的理化性质Table 1 Physiochemical properties of NHP and DNHP

2.2 单糖组成分析

如图2所示，NHP主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸组成。半乳糖醛酸含量较高，说明是果胶类多糖。3种降解多糖的单糖种类与NHP相同，说明H2O2-VC降解没有改变多糖的单糖类型。H2O2-VC降解条斑紫菜多糖中也有相似的发现[20]。由表1可知，降解后单糖占比发生了改变，半乳糖醛酸、甘露糖含量下降，鼠李糖含量增加。半乳糖醛酸含量下降，说明H2O2-VC产生的羟自由基更易作用于果胶多糖主链聚半乳糖醛酸区的糖苷键，这与超声加速H2O2降解果胶多糖的结果相似[10]。在侧链中，羟自由基优先攻击甘露糖附近的糖苷键，其次攻击木糖、阿拉伯糖等中性糖附近的糖苷键，而在鼠李糖附近的糖苷键较稳定，断裂的短糖链在透析过程中除去，可能是甘露糖含量下降、其他中性糖含量变化不大、鼠李糖富集的原因。

图2 NHP和DNHP的离子色谱图Fig.2 Ion chromatograms of NHP and DNHP

2.3 红外光谱分析

如图3所示，NHP和DNHP的特征吸收峰相似，说明降解后没有改变多糖的主要官能团结构。在3 378 cm－1处为O—H伸缩振动峰。1 744、1 615 cm－1处为果胶多糖的特征吸收峰[21]，多糖降解后，峰强度变弱。1 615 cm－1和1 440 cm－1处的吸收峰说明多糖降解前后都含有糖醛酸[16]。在1 024 cm－1处为果胶多糖中半乳糖醛酸的特征吸收峰[22]，910 cm－1和536 cm－1处表明了α-糖苷键的存在[6]。

图3 NHP和DNHP的傅里叶红外光谱图Fig.3 FT-IR spectra of NHP and DNHP

2.4 三股螺旋结构分析

由图4可知，与空白组对比，当NaOH浓度为0 mol/L时，NHP和DNHP的最大吸收波长没有发生红移，说明多糖降解前后都不具有三股螺旋结构。当NaOH浓度逐渐增加时，最大吸收波长逐渐减少，说明碱液破坏了多糖的氢键[23]。

图4 NHP和DNHP在不同浓度NaOH中与刚果红溶液的最大吸收波长Fig.4 Maximum absorption wavelengths of mixtures of Congo red with NHP or DNHP at different NaOH concentrations

2.5 流变学分析

由图5A可知，随着降解时间的延长，多糖的表观黏度显著下降。未降解多糖NHP的表观黏度随剪切速率增加而降低，这是典型的剪切变稀现象，说明NHP是非牛顿流体。DNHP-1和DNHP-2在低剪切速率0.1～10 s－1内，呈现剪切变稀，然而在高剪切速率10～100 s－1内，表观黏度几乎不变，接近牛顿流体。此外，DNHP-3的表观黏度随剪切速率的增加几乎保持不变，表明DNHP-3接近牛顿流体。这可能是因为随着降解时间的延长，多糖链糖苷键断裂的数量增多，导致分子间相互作用力减弱，多糖链发生解聚，多糖重新缠结的速度低于断裂速度[24]。这些结果表明H2O2-VC降解显著改变了多糖的流变行为，这与已有报道黑加仑多糖在高超声功率下也转化为牛顿流体相似[25]。

由图5B可知，降解前后多糖的G’和G’’随角频率增加而增加，DNHP的模量低于NHP。NHP与DNHP溶液均具有黏弹性，在低频率时G’’大于G’，表现为液体黏性；在高频率时G’’小于G’，表现为弱凝胶性质。此外，4种多糖的交叉频率分别为43.18（NHP）、15.85（DNHP-1）、10.00 rad/s（DNHP-2）和2.51 rad/s（DNHP-3），表明随着降解时间的延长，多糖的交叉频率逐渐降低。Gao Jie等[26]认为低交叉频率具有更好的凝胶和稳定性能。因此，降解提高了多糖的固体弹性，为其在食品、化妆品等领域的添加提供了理论依据。

图5 NHP和DNHP的流变性Fig.5 Rheological properties of NHP and DNHP

2.6 功能特性分析

持水性用于评价样品结合水的能力，与样品增稠、稳定能力及质构、感官性质密切相关[27]。如图6A所示，与NHP（（1.50±0.11）%）相比，DNHP的持水性分别为（3.12±0.02）%、（3.11±0.16）%、（3.42±0.13）%，说明多糖分子质量越小，持水性越高。这可能是NHP降解后，暴露出来的羟基比例增加，从而促进多糖的持水能力。NHP的持油性为（11.04±0.29）%，显著高于DNHP。此外，随着分子质量的降低，持油性逐渐降低。高分子质量的多糖，黏度较大，与油分子结合的能力更强[28]。NHP的持水性、持油性均优于刺梨多糖、蓝靛果多糖[24,29]，说明NHP和DNHP可用作食品中保水剂、风味保持剂。

如图6B所示，NHP和DNHP的乳化活性与乳化稳定性均低于常用乳化剂大豆卵磷脂。与DNHP相比，NHP的乳化活性与乳化稳定性分别为（39.92±1.22） m2/g、（21.04±0.45） min，高于DNHP，说明多糖降解后乳化性降低。推测原因是降解后蛋白质含量降低，NHP中的支链结构与少量蛋白质共价结合，增强多糖乳化能力[17]。此外，高支链结构、高分子质量的多糖乳化性更强[30]，因此推测多糖分子质量大小与乳化性正相关。

图6 NHP和DNHP的功能特性Fig.6 Functional characteristics of NHP and DNHP

2.7 抗氧化活性分析

由图7A、B可知，在0.125～2 mg/mL质量浓度范围内，NHP与DNHP对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基的清除率呈剂量依赖性。在同一质量浓度下，DNHP-2对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基的清除率均高于NHP及其他降解多糖，低于VC。NHP、DNHP-1、DNHP-2、DNHP-3清除DPPH自由基的IC50分别为0.93、0.74、0.48、0.57 mg/mL；质量浓度为2 mg/mL时，清除率分别为（65.18±1.06）%、（74.29±2.18）%、（87.65±0.71）%、（85.47±1.71）%。清除ABTS阳离子自由基的IC50分别为0.73、0.54、0.41、0.44 mg/mL；质量浓度为2 mg/mL时，清除率分别为（69.36±0.54）%、（77.37±1.29）%、（87.13±0.84）%、（82.81±0.52）%。说明DNHP对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基的清除率均高于NHP。清除能力按从高到低顺序为VC＞DNHP-2＞DNHP-3＞DNHP-1＞NHP。

由图7C可知，在0.25～4.00 mg/mL质量浓度范围内，NHP与DNHP对羟自由基的清除率与质量浓度正相关。NHP、DNHP-1、DNHP-2、DNHP-3清除羟自由基的IC50分别为2.41、1.88、1.16、1.80 mg/mL，高于VC（0.25 mg/mL）。相同质量浓度时，DNHP-2对羟自由基的清除率均高于NHP及其他降解多糖。质量浓度为4.00 mg/mL时，多糖清除率分别为（65.68±0.89）%、（74.35±1.33）%、（82.69±0.32）%、（80.17±1.24）%。清除能力按从高到低顺序与DPPH自由基、ABTS阳离子自由基一致。

图7 NHP和DNHP的抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activities of NHP and DNHP

研究表明，多糖的抗氧化活性与溶解度、单糖组成、黏度、分子质量、三股螺旋结构等性质紧密相关，其中，分子质量对多糖抗氧化活性有显著影响[31]。低分子质量多糖的游离羟基比例高，通过直接与自由基作用终止自由基链反应或提供电子将自由基还原为更稳定的形式，从而提高抗氧化活性[6]。多糖降解后溶解度增加，能够与自由基接触的活性位点增多[12]。NHP与DNHP在单糖种类、官能团与三股螺旋结构上相似，说明NHP抗氧化活性的提高与分子质量降低，黏度降低，溶解度增加及单糖浓度占比改变相关。此外，当降解时间为60 min时，制备的DNHP-2在降解多糖中抗氧化效果最佳，说明在降解中合理控制时间对提升多糖活性有重要意义，这与超声降解马尾藻多糖的结果一致[16]。

3 结 论

本研究应用H2O2-VC联合降解NHP，制备了3种低分子质量多糖DNHP，分子质量分别为129、46、15 kDa。3种降解多糖的单糖种类与未降解多糖一致，但浓度占比存在差异，降解体系生成的羟基更易攻击HG区的半乳糖醛酸。H2O2-VC降解后多糖的主要官能团结构没有改变。随着降解时间的延长，多糖的表观黏度下降，固体弹性增加，降解显著改变了多糖的流变行为。此外，NHP具有良好的持油性、乳化性，DNHP具有较好的持水性。体外抗氧化实验发现，降解后多糖对自由基清除能力显著提高，其中抗氧化效果最佳的多糖为降解时间60 min的低分子质量DNHP-2多糖。这些结果表明控制H2O2-VC降解时间能够改变NHP的分子质量、流变性和其他功能特性。因此，NHP在食品、化妆品和药品中有潜在应用。