基于Illumina MiSeq高通量测序技术分析贵州水豆豉中细菌多样性

邓高文，刘 洋,，李 跑，廖卢艳，尹含靓，蒋立文,，覃业优，肖 何

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；3.湖南坛坛香食品科技有限公司，湖南 长沙 410300）

豆豉以大豆为原料，经过浸泡、蒸煮、摊凉、制曲、发酵等一系列工艺制成的一种中国传统调味副食品[1-3]。豆豉可分为曲霉型、毛霉型、细菌型等类型。国内一般生产的细菌型豆豉主要是水豆豉，其中贵州水豆豉是一种地方特色的发酵豆制品，在贵州、湖南湘西、四川等地以凉拌食用为主。与其他发酵豆豉相比，产品生产周期较短，气味特殊，滋味独特。水豆豉一般在25～30 ℃进行自然发酵，发酵微生物以细菌为主，发酵后黄豆表面发白具有黏度丝状物，经过加入含有辣椒面、食盐及其他香辛料的汤汁后继续发酵成为一种特殊风味豆制品。

随着Illumina MiSeq高通量测序技术的不断发展，豆豉微生物菌落多样性变化被广泛研究[4-6]。李薇等[7]利用高通测序技术对制曲阶段及后发酵阶段永川毛霉型豆豉曲料中微生物的群落结构及动态演替规律，发现在制曲阶段发挥主导作用的有根霉属、曲霉属和芽孢杆菌属（Bacillus），后发酵阶段微生物菌落结构发生变化较大，但Bacillus具有较稳定的相对丰度。赵文鹏等[8]依托高通量测序技术揭示曲霉型豆豉发酵中细菌群落组成和演替规律，发现葡萄球菌属是整个发酵过程的核心菌属，发酵过程中细菌群落的组成变化明显，还原糖含量、温度和pH值可能是曲霉型豆豉细菌群落演替的推动因子。而目前对贵州水豆豉微生物的研究主要集中在优势均属的分离纯化，对其发酵过程中的微生物多样性变化的相关研究不多。

本实验以贵州水豆豉几个主要发酵阶段的微生物群落构成为研究对象，用Illumina MiSeq高通量测序技术对贵州水豆豉样品中的细菌菌群结构及多样性变化规律进行研究，同时采用纯培养分离鉴定法进行关键核心微生物鉴定，以期为贵州水豆豉标准化控制提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

贵州水豆豉发酵过程及后发酵的坯料，分别是黄豆蒸熟后冷却到40 ℃后自然控制温度28～32 ℃之间发酵24、48 h，以及后发酵放置24 h的产品（冷开水加入一定比例的干辣椒面、香辛料、12%～15%食盐，产品最终平衡盐度8%），取样编号分别为DCFW1、DCFW2、DCFW3，来自贵州某企业。

营养琼脂培养基、酪蛋白琼脂培养基、营养肉汤广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.2 试剂

甲醛溶液 湖北奥生新材料科技有限公司；氢氧化钠、邻苯二甲酸氢钾 国药集团化学试剂有限公司；酚酞溶液Phusion热启动Flex 2X预混液（Pusion Hot Start Flex 2X Master Mix） 上海仪涛生物仪器有限公司；DL2000 DNA Marker 日本TaKaRa公司；核酸定量分析试剂盒（Qubit dsDNA HS Assay Kit） 美国英杰生命技术有限公司；Biowest Agarose琼脂糖G-10 法国Biowest公司；50×TAE 缓冲液 生工生物工程（上海）股份有限公司；AxyPre聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）清洁试剂盒 美国爱思进公司；RStool DNA试剂盒 美国Omega公司。

1.2 仪器与设备

JE 502电子天平 上海浦春计量仪器有限公司；LDZX-50 KBS高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1FD无菌操作台 苏州净化设备有限公司；LRH-250生化培养箱 上海飞越实验仪器有限公司；CX23LEDRFS1C生物显微镜 奥林巴斯（广州）工业有限公司；PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；5424型常温离心机 德国Eppendorf公司；Biocen 22 R冷冻离心机 德国Wiggens公司；WH-861型旋涡振荡仪 太仓华利达实验室设备公司；DK-8 D型三温三控恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司；A 200型PCR仪 杭州朗基科学仪器有限公司；MiSeq测序仪美国Illumina公司；EPS 300型电泳仪、Tanon-2500型凝胶成像仪 上海天能公司；DWHL 388型超低温冷冻储存箱 中科美菱低温科技有限责任公司；水系微孔滤膜（Φ50 mm，孔径0.22 μm） 海宁郭店桃园膜分离设备厂。

1.3 方法

1.3.1 豆豉16S rDNA高通量测序

1.3.1.1 豆豉样品总DNA的提取

将贵州水豆豉（DCFW1、DCFW2、DCFW3）搅拌均匀后各取50 g，然后用孔径为0.22 μm的水系微孔滤膜进行抽滤。将抽滤完成后的滤膜剪碎放入微型离心管中，按照R Stool DNA试剂盒说明书提取总DNA。

1.3.1.2 豆豉16S rDNA高通量测序方法

以豆豉总DNA为模板进行细菌16S rDNA V3-V4区域扩增。引物：338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。DNA模板50 ng、2×Taqmaster Mix 15 μL，正向和反向引物各1 μL，加入ddH2O定容至30 μL。充分混匀按以下程序进行PCR：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，65 ℃延伸30 s，5 个循环；98 ℃变性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，反应35 个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

取PCR产物10 μL用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，将检测合格的样品送至杭州联川生物技术有限公司进行高通量测序。

1.3.1.3 数据分析

对下机数据首先根据样品的条形码信息对数据进行拆分，再根据双端序列的重叠关系将序列拼接成长的tags，并将序列上建库引入的条形码和引物序列去除。为了保证后续结果的可靠性，使用Vsearch（V2.3.4）软件过滤去除长度小于100 bp的序列、含不确定碱基达5%以上的序列及嵌合体序列等低质量序列[9]。再以平均邻近聚类算法通过Verseach（V2.3.4）将具有97%以上相似性的序列划分为同一个操作分类单元（operational taxonomic units，OTU），挑选代表性序列使用[10]。在核糖体数据库项目（ribosomal database project，RDP）中进行序列比对，明确序列的分类地位。利用MAFFT（V 7.310）软件对不同类群优势种群的差异进行多序列比对，研究不同OTU间的系统发育关系。同时，可根据每个OTU代表序列与RDP数据库的比对，获得各样本的物种注释结果，经过分类统计后可得到各分类水平上物种的相对丰度信息。使用Verseach（V2.3.4）计算样品的各项数据指标，通过α和β多样性分析研究单个样本中物种多样性和多个样本间菌群结构的差异[11-12]。

1.3.2 发酵微生物的初步分离鉴定

取贵州水豆豉50 g（均匀取样）于无菌烧杯中，置于90 ℃水浴锅中加热15 min后，取其中25 g作为检测样品。在无菌条件下，将检测样品25 g用灭菌过的生理盐水配制10－1～10－10稀释度的菌液，充分混合均匀[13-14]。采用涂布法分离主要耐热微生物。将培养皿倒置于37 ℃条件下恒温培养箱中培养24～48 h。对菌落进行形态鉴定，共发现31 株菌种（1～31），通过革兰氏染色，共鉴定出9 株，分别命名：3、6、8、9、16、21、23、26、31。同时采用酪蛋白琼脂培养基对产蛋白酶的微生物进行鉴定，并观察这些菌落的周围透明圈形成情况，分别测量透明圈和菌落的直径长短，计算之后比较比值大小；选取比值较大的菌株按照要求做革兰氏染色实验及镜检进行初步鉴定，确认所筛选菌株为芽孢杆菌后进行重复实验，再编号比较比值大小[15]。

1.3.3 发酵微生物的鉴定

对酪蛋白培养2 次实验结果进行记录计算，在此基础上选择透明圈与单一菌落直径比值较大的菌落，按照要求进行涂片后做革兰氏染色实验，显微镜下观察，防止在第2次酪蛋白培养之后菌株受到污染而挑错菌的情况发生。再选取以上所述革兰氏阳性菌进行VITEK MS全自动微生物质谱鉴定系统鉴定[16]。

1.4 数据处理

按照生物学样品处理基本要求，所有样品均有4 个生物学重复样品。采用SPSS 18.0和Excel 2019进行数理统计分析和相关性分析[17-18]。

2 结果与分析

2.1 3种不同样品的OTU统计及分类学分析

对测序获得的296 063 条有效数据进行聚类分析，OTU聚类后3 组样品中总共得到1 124 个OTU，根据3 组样品中的OTU绘制Venn图（图1）。

图1 3种样品中的OTU分布图Fig.1 Venn diagram showing distribution of bacterial OTUs in three douchi samples

由图1可知，DCFW1中含有782 个OTU，DCFW2中含有676 个OTU，DCFW3中含451 个OTU。说明DCFW1和DCFW2的样本多样性较好，这可能是由于DCFW3经过后发酵在食盐和香辛料等的作用下微生物总数下降[19]。DCFW1和DCFW2样品中相同的OTU有530 个，说明二者微生物种群具有极大的相似性。DCFW3和DCFW2样品中相同的OTU仅221 个，这可能是由于拌料时引入的外界微生物的污染和食盐的抑菌作用等导致。3种样品共有的OTU为127 个，揭示这些微生物在发酵以及调味后的水豆豉中一直起重要的作用。

PCA（图2）表明，PC1和PC2两主轴解释度和为89.13%，说明其已能够反映样品中大部分的信息，就样品分布来看DCFW1、DCFW2相距较近，说明两者菌群结构相似，而DCFW3与DCFW1、DCFW2相距较远，说明DCFW3在外界微生物的污染和加盐等作用下，菌群结构出现了明显变化，这与图1结果类似。

图2 PCA结果Fig.2 PCA plot

2.2 3 个样品的物种分类与注释

将前面的OTU代表序列分别与NT-16S数据库进行比对，得到各个样本所有OTU的物种注释。3 个样品门水平的分类图见图3。3 个样品一共注释了6 个门类：厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）、未知细菌类（bacteria_unclassified）。厚壁菌门在DCFW1、DCFW2、DCFW3中占绝对优势的菌种。变形菌门在DCFW2中含量最高，DCFW1次之、DCFW3最少。而拟杆菌门只有在DCFW1含有。随着发酵时间的延长以及食盐等香辛料的加入，产芽孢的厚壁菌门不断增加，拟杆菌门、变形菌门等不断减少。此外，从菌群结构和丰富度看DCFW3与DCFW2和DCFW1差异较大，其中DCFW1含有的门类菌种最多。

芽孢杆菌属和厚壁菌门是贵州水豆豉主要微生物[20]。由图3可知，3 个样品中的芽孢杆菌属相对丰度分别为DCFW3（87.8%）＞DCFW2（64.36%）＞DCFW1（32.97%），沙雷氏菌属（Serratia）可以发酵并利用麦芽糖，可产气产色素[21]，但其只存在于DCFW1中（1.31%）。厚壁菌门丰度不断增加、变形菌门不断减少，尤其DCFW3阶段，可能是拌料加盐导致。从发酵各阶段的分布看，细菌多样性复杂程度不断减弱。芽孢杆菌属随着发酵时间的延长，丰度不断增加，杂菌不断减少，这可能是随着发酵曲温达到50 ℃左右，适合嗜热细菌的生长，而其他一些不耐高温的微生物则被抑制。变形杆菌属（Proteus）、短芽孢杆菌属（Brevibacillus）丰度也在不断减少，可能由于拌料时盐、香辛料等抑菌成分的加入所导致[22]。因芽孢杆菌属为贵州水豆豉主要微生物且后期发酵曲温较高，因此进行耐热微生物分离鉴定实验。

图3 3 个样品的门（a）、属（b）水平分类Fig.3 Bacterial community composition of three douchi samples at the phylum (a) and genus (b) levels

2.3 耐热微生物分离鉴定结果

2.3.1 革兰氏染色实验初步鉴定结果

革兰氏染色实验初步鉴定结果（图4）显示，第1次酪蛋白琼脂培养后所筛菌株均在革兰氏染色后均呈紫色，菌体较短且均有芽孢，因此初步判定所检菌均为革兰氏阳性芽孢杆菌。

图4 革兰氏染色镜检结果（×100）Fig.4 Microscopic examination of gram stained-isolates (× 100）

2.3.2 选择性酪蛋白琼脂筛选高蛋白酶活性微生物

通过对酪蛋白琼脂实验的筛选菌落进行质地形态的观察分析，可知3、9号，6、21和31号，8、16、23及28号各是同一种菌。结合第2次酪蛋白琼脂实验的结果，根据透明圈直径与菌落直径的比值，选择（2）、（11）、（16）、（28）和（31）号进行VITEK MS微生物质谱鉴定。

表1 酪蛋白琼脂培养结果及菌落形态Table 1 Colonial morphology of isolates cultured on casein agar plates

2.3.3 VITEK MS微生物质谱鉴定

经VITEK MS全自动微生物质谱鉴定（图5）表明，（2）、（11）、（16）和（28）号均有枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和死谷芽孢杆菌4种可能。因该3种菌同属枯草芽孢杆菌属，在质谱鉴定过程中的生化反应比较相似，且目前VITEK系统的鉴定只能达到属水平，因此将该结果结合菌落形态分析确定菌株种类[23]。死谷芽孢杆菌一般从土壤中分离得到，因此从水豆豉分离出的可能不大。枯草芽孢杆菌是纳豆中主要微生物，属于水豆豉发酵的优势菌株。蜡样芽孢杆菌是致病菌[24]，说明在水豆豉自然发酵过程中存在安全风险。

图5 VITEK MS全自动微生物质谱鉴定图Fig.5 Mass spectra of four strains with high protease activity identified by VITEK MS

3 讨 论

豆豉独特的感官风味和丰富的营养价值与参与发酵的微生物菌群结构密切相关。由于豆豉制作多采用传统工艺开放式生产，各地的气候、原料、发酵工艺等区别，从而造就了其极具地方特色的特点。目前，已有研究者利用高通量测序技术对湖南[25]、江西[26]和甘肃[27-28]等地区豆豉的微生物多样性进行了分析。然而，作为药食两用的贵州水豆豉，其微生物多样性却较少被关注。本研究利用高通量测序技术结合分离纯化技术对贵州水豆豉进行细菌多样性分析。结果表明：贵州水豆豉细菌组成较为丰富，主要以厚壁菌门、变形菌门和芽孢杆菌属为主，含少量短芽孢杆菌属、沙雷氏菌属等。与甘肃[27-28]传统水豆豉样品厚壁菌门、变形菌门和芽孢杆菌属均为优势菌种，而江西[26]未检出，主要以葡萄球菌属、乳杆菌为主。湖南浏阳[25]样品虽以厚壁菌门为主，但真菌更复杂，有乳杆菌属、微球菌属、肠杆菌属等。

4 结 论

本实验基于Illumina MiSeq高通量测序技术分析贵州水豆豉中细菌多样性，同时结合贵州水豆豉中耐热性产蛋白酶微生物进行分离鉴定。在3 个样品中共发现了在门水平共注释了6 个门类，属水平共分为21 属类。厚壁菌门和芽孢杆菌属是占绝对优势的菌，其次是变形菌门和变形杆菌属。在整个发酵时期芽孢杆菌属都随着发酵时间的延长丰度不断增加。利用VITEK技术从水豆豉中鉴定出4 株菌，分别为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌。其中，蜡样芽孢杆菌具有致病性，说明在水豆豉自然发酵过程可能存在一定的安全隐患，还有待进一步研究。