基于高通量测序分析储藏稻谷中的真菌群落结构与优势菌属

徐圆程，刘 慧，王光宇，吴红影，邱伟芬

（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室，江苏 南京 210023）

稻谷是食用人口最多的作物之一[1]，在中国，有65%的人口以稻米为主食[2]，因此稻谷的安全性就显得尤为重要。在稻谷储藏过程中，当温度、湿度条件达到适合真菌生长条件时，这些真菌便会分解并利用稻谷中营养物质，使其品质发生劣变，这会对粮食安全与粮食品质造成严重威胁[3-4]，有些真菌甚至会产生真菌毒素[5]，进而威胁食用者的健康[6]。因此，研究不同温度和湿度下储藏稻谷中的真菌菌群结构有重要意义，可以更有针对性地控制储藏条件，同时也为减少储藏稻谷霉变发生几率以及提高储藏稻谷品质提供理论依据。

传统方法分析微生物群落多样性及群落结构需要先对可培养微生物进行分离、鉴定，再进行分析，而在样品中可培养微生物往往只占总微生物的不到10%[7]，因此，这也就说明了传统方法不能全面评估微生物群落的组成及结构。随着高通量测序技术的发展，越来越多的研究将这一技术运用于食品微生物群落特征的鉴定[8]。刘金等[9]利用高通量测序技术分析了广西百色地区储藏油茶籽中霉菌的多样性，发现油茶籽壳和仁中的污染霉菌主要都为曲霉属（Aspergillus）和节担菌属（Wallemia）。吴进菊等[10]通过高通量测序聚类分析和主成分分析（principal component analysis，PCA），发现大头菜在发酵前期的优势菌属为明梭孢属（Monographella），而中、后期的优势菌属为德巴利氏酵母属（Debaryomyces）和接合酵母属（Zygosaccharomyces）。卫春会等[11]采用高通量测序比较分析汾酒酒醅发酵过程中的真菌群落结构，结果显示酒醅发酵初期的优势菌都是毕赤酵母（Pichia），到发酵后期，两种酒醅中的优势菌分别变为酿酒酵母（Saccharomyces）和假丝酵母（Candida）。此外，高通量测序技术作为食品行业一项新兴的技术，也已广泛运用到香肠[12]、酸菜[13]、腐乳[14]、豆豉[15]等的微生物群落分析研究中。但鲜有报道将高通量测序技术运用到系统测定不同温度、湿度条件下储藏稻谷的真菌群落结构多样性研究中。

本研究将湖南衡阳仓储2017年稻谷在不同温度（10、20、25、30、40 ℃）和环境相对湿度（relative humidity，RH）（43%、75%和85%）条件下储藏16 周后，采用高通量测序技术分析不同储藏条件下样品中真菌群落结构与优势菌属，旨在为调整仓储条件及对优势真菌的针对性防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

稻谷为湖南衡阳2017年仓储稻谷。

碳酸钾、氯化钠、氯化钾（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；植物基因组DNA提取试剂盒天根生化科技有限公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒美国Axygen公司；DL2000 DNA Marker、2×RapidTaqMaster Mix 南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

9700型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国ABI公司；HiSeq高通量测序平台 美国Illumina公司；5810R离心机 德国Eppendorf公司；WH-2微型涡旋混合仪 上海沪西分析仪器厂有限公司；GNP-9160型隔水式恒温培养箱 上海三发科学仪器有限公司；电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；移液器、 NanoDrop One超微量分光光度仪美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

参照Wang Xihai等[16]的方法，分别配制饱和碳酸钾溶液、饱和氯化钠溶液和饱和氯化钾溶液，以人工制造43% RH、75% RH和85% RH的环境。在无菌条件下，将50 g稻谷样品分装在150 mm无菌培养皿中，一共准备45 份，然后分别将培养皿转移至盛有不同饱和盐溶液的干燥器中，接着将干燥器分别放入5种温度（10、20、25、30、40 ℃）的人工气候箱内，储藏16 周后进行后续实验。

1.3.2 基因组DNA提取及PCR

按照天根生物植物基因组DNA提取试剂盒说明书的步骤，提取稻谷样品中总DNA，提取的总DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，经超微量分光光度计检测浓度，检测合格后将DNA样品保存在－20 ℃。以样本中微生物总DNA为模板，以通用引物ITS1/ITS2扩增真菌的ITS基因序列[17]。PCR采用25 μL反应体系：总DNA 1 μL，2×RapidTaqMaster Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，添加双蒸水9.5 μL补充至25 μL。PCR条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，共30 个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。

1.3.3 测序过程

检测合格的样品构建文库：回收目的扩增片段，用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4 PNK将打断形成的黏性末端修复成平末端，再通过3’端加碱基“A”，使得DNA片段能与3’端带有“T”碱基的特殊接头连接，最后，用合格的文库进行Cluster制备和测序。

1.3.4 数据分析

对于测序结果，首先进行数据处理过滤，获得Clean Date后进行拆分[18]，之后进行序列拼接得到高变区的Tags[19]。在97%的相似度下进行可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）聚类，得到代表序列；再将Tags与代表序列作比对，得到每个样品在OTU的丰度分析[20]。得到OTU代表序列之后，将序列与UNITE Version7数据库进行比对，在置信度阈值为0.6的条件下，对物种进行注释，并过滤注释结果。过滤完成后，选择剩余的OTU进入后续分析。

2 结果与分析

2.1 稻谷真菌测序数据统计

经质控处理和OTU聚类，原始稻谷和储藏后稻谷中真菌序列统计如表1所示，样品优化序列占比都达到80%以上，原始稻谷与不同条件储藏的稻谷，共计48 个样品中共产生640 个OTU，其中20 ℃、43% RH条件下产生的OTU数量最多，30 ℃、75% RH条件下产生的OTU数量最少。另外还发现，除40 ℃，其他各储藏温度下75% RH和85% RH条件下OTU数都少于43% RH，可能是高湿度条件抑制了部分微生物的生长。

表1 原始稻谷及在不同条件下储藏后稻谷中真菌的序列统计Table 1 Amplification sequence statistics of fungi in fresh rice and rice stored under different conditions

2.2 稻谷真菌群落多样性分析

Sobs指数、Chao指数、ACE指数、Shannon指数越大，说明菌群丰度和多样性越大；而Simpson指数越大，则说明稻谷中的真菌群落多样性越小[21]。覆盖率可以评估样品的样本序列在文库中的覆盖程度。由表2可知，所有样品的覆盖率都达到0.99以上，表明样品中序列未被测到的概率较低。在20 ℃、43% RH条件下储藏后的稻谷Sobs指数、Chao指数和ACE指数均最大，表明在此储藏条件下的稻谷真菌群落物种的丰富度最大，而30 ℃、75% RH条件下这些指数最低，表明其真菌群落丰富度最小。同时，经比较得出，在10 ℃、85% RH条件下的稻谷样品Shannon指数最大，Simpson指数最小，表明此储藏条件下的稻谷真菌群落物种均匀度最高。总体来看，在20 ℃、43% RH条件下储藏后的稻谷真菌群落多样性最高，30 ℃、75% RH储藏条件下稻谷真菌群落物种多样性最低。由此可见，20 ℃、43% RH的条件适合更多数真菌的生存。

表2 全部稻谷样品中的真菌群落多样性指数统计Table 2 Statistics of diversity indexes of fungal community in all rice samples

2.3 稻谷真菌群落组成分析

原始稻谷及在不同条件下储藏后的稻谷中，去除未分类的真菌群落共包含5 个门，如图1所示，分别为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、芽枝霉门（Blastocladiomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）和毛霉门（Mucoromycota）。其中Ascomycota为优势菌门，相对丰度为2.53%～96.86%；其次为Basidiomycota，相对丰度为0.02%～9.39%。可以看到，原始稻谷样品中，Ascomycota占比最高，平均占比达57.78%，其次是Basidiomycota 1.58%。当温度为20、25、30 ℃，相对环境湿度为75% RH和85% RH时，Ascomycota和Basidiomycota丰度处于相对低的水平。

图1 原始稻谷及不同温度、湿度条件储藏后稻谷中真菌门水平相对丰度Fig.1 Relative abundance of fungi at the level of phylum in fresh rice and rice stored under different temperature and humidity conditions

选择原始稻谷样品及在不同温度、湿度条件储藏后的稻谷样品测序结果中共有、相对丰度较大的属水平序列和种水平序列群落，去除测序结果中的unclassified和unidentified，得到稻谷真菌属水平和种水平的相对丰度图。由图2A可知，在原始稻谷样品中，各菌属分布较为平均，但主要菌属是白僵菌属（Beauveria）、Aspergillus和赤霉属（Gibberella）。其中在10 ℃储藏时，稻谷霉菌群落中主要菌属为Beauveria、黑孢属（Nigrospora）、Aspergillus、竹黄菌属（Shiraia）和Wallemia。在20 ℃储藏时，43% RH下储藏的稻谷中主要菌属是Nigrospora、卵球菌属（Ophiosphaerella）和Gibberella；而75%和85% RH下稻谷主要菌属是Aspergillus、Beauveria和Candida。在25 ℃储藏时，稻谷主要菌属是Beauveria、Aspergillus、Nigrospora、链格孢属（Alternaria）和Candida。在30 ℃储藏时，稻谷主要菌属是Aspergillus、Candida、Nigrospora、Gibberella、Ophiosphaerella和Alternaria。在40 ℃储藏时，43% RH下稻谷主要菌属是Nigrospora、Beauveria和Alternaria；75%及85% RH下稻谷主要菌属是Aspergillus、Nigrospora和Beauveria。综上所述，无论在哪种温度条件中，75%和85% RH下的优势菌属都包含Aspergillus，且随着温度的升高，Aspergillus占比也相对变大，这与杨晓蓉等[22]储藏温度越高，稻谷含水量越大，越容易发生霉变的研究结果一致。

图2 原始稻谷及不同温度、湿度条件储藏后稻谷中真菌属水平（A）和种水平（B）的相对丰度Fig.2 Relative abundance of different fungal genera (A) and species (B)in fresh rice and rice stored under different conditions

从种水平看，在10 ℃储藏时，稻谷中主要菌种是白僵菌（Beauveria bassiana）、黑孢霉（Nigrospora oryzae）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、Ophiosphaerella agrostidis和竹黄菌（Shiraia bambusicola）。在20 ℃储藏时，43% RH下储藏的稻谷主要菌种是N.oryzae、O.agrostidis、错综赤霉（Gibberella intricans）和A.flavus；75%和85% RH下的稻谷中主要菌种是B.bassiana和A.flavus。在25 ℃储藏时，稻谷中主要菌种是B.bassiana、A.flavus、黑曲霉（Aspergillus nigers）和O.agrostidis。在30 ℃储藏时，43% RH下储藏的稻谷主要菌种是赭曲霉（Aspergillus ochraceus）、A.flavus和热带假丝酵母（Candida tropicalis）；75% RH下的稻谷中主要菌种是A.flavus、G.intricans、O.agrostidis和B.bassiana；85% RH下的主要菌种是A.flavus、链格孢霉（Alternaria longissima）、O.agrostidis和B.bassiana。在40 ℃储藏时，稻谷中主要菌种是N.oryzae、B.bassiana、A.flavus、A.longissima和O.agrostidis。综上所述，A.flavus在各温度、湿度条件下都占有较大比例，且当相对环境湿度达到85%时，在各菌种中占有最大比例，这与柳显文[23]研究中A.flavus生长最适RH为80%～90%的结果一致。A.flavus产生的黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是稻谷中主要污染真菌毒素[24-25]，所以控制稻谷储藏条件减少A.flavus的产生，才能从源头上减少稻谷中AFB1的污染。另外A.ochraceus在30 ℃、43% RH条件下丰度明显升高，这与刘彬[26]研究的赭曲霉菌的最佳生长温度20 ℃和湿度18%～22%的结果有所不同，推测可能的原因是低湿度条件抑制了A.flavus的生长[27]，从而导致了A.ochraceus丰度的上升。A.ochraceus产生的赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）也是谷物中重要的污染真菌毒素[28-29]，OTA已被确定具有肾毒性、免疫毒性、致癌性和致畸性[30]，因此在储藏过程中也应避开这一储藏条件。

2.4 不同储藏条件下稻谷中真菌群落差异分析

在97%的相似度下，得到每个稻谷样品的OTU数，利用Venn图可以展示处于不同储藏状态下的稻谷样品中共有和各自特有的OTU数目，直观展示稻谷样品间OTU的重叠情况。Venn图中不同颜色图形代表不同储藏条件，不同颜色之间交叠部分数字为不同储藏条件下的稻谷共有的OTU数。

由图3可知，原始稻谷样品和不同温度、湿度条件储藏后的稻谷样品中真菌群落之间存在特性和共性。原始稻谷样品与10 ℃储藏条件下的稻谷相比，有41种特性OTU，与20 ℃相比，有46种特性OTU，与25 ℃相比，有75种特性OTU，与30 ℃相比，有76种特性OTU，与40 ℃相比，有44种特性OTU。可以看出25 ℃和30 ℃条件下的真菌群落差异性相较原始稻谷样品更大。说明这两个温度对稻谷储藏过程中真菌群落的改变影响最大。相同温度下，不同环境RH储藏的稻谷真菌之间也存在特性和共性。在同一温度下时，43% RH下储藏的稻谷真菌特性OTU相对最多，且随着环境RH的升高，与原始稻谷共有的OTU数量减少。这说明相同温度条件下，湿度越高储藏稻谷中真菌群落的变化就越大。相同环境RH下，不同温度储藏的稻谷真菌群落之间也存在特性和共性。43% RH下，稻谷真菌共性OTU有88种，10、20 ℃和40 ℃时特性OTU较25 ℃和30 ℃多，说明43% RH时，10、20 ℃和40 ℃条件下的真菌群落多样性比25 ℃和30 ℃条件下高；75% RH和85% RH下，稻谷真菌共性OTU分别有47种和42种，且在40 ℃时特性OTU数远多于其他几个温度，说明40 ℃ 75% RH和85% RH的条件下稻谷真菌群落多样性相对较高。尽管通过高通量测序得到很多的真菌种类，但是也只有少数真菌会在储藏过程中生长发育，并在一些特定的外部条件作用下才会产生不良的影响[31]。

图3 原始稻谷及不同条件储藏后稻谷中真菌的OTU分布比较Venn图Fig.3 Venn diagram of OTU distribution of fungi in fresh rice and rice stored under different conditions

对稻谷中真菌群落进行PCA，图中不同条件储藏的稻谷中真菌群落距离越近，则表示群落相似度越高。由图4可知，原始稻谷样品与10 ℃、43% RH储藏条件下的稻谷样品位置相对较近，说明这两种储藏状态下的稻谷样品中真菌群落物种多样性差异较小；原始稻谷样品与剩余其他储藏条件下的稻谷样品位置间均相对分散，说明稻谷样品之间真菌群落物种多样性差异较大。在相同储藏温度下，10、20、25、40 ℃时，3种不同环境RH中的稻谷样品位置相对分散，说明这些储藏条件下的稻谷样品的真菌群落差异性较大，而30 ℃时，75% RH和85% RH中的稻谷样品位置几乎重叠，说明此储藏条件下的稻谷真菌群落多样性差异较小。在相同环境RH下，可以发现在43% RH时，原始稻谷样品与不同储藏温度下的稻谷样品位置相对分散，说明稻谷真菌群落物种多样性差异较大；75%、85% RH下，20、25 ℃和30 ℃的稻谷样品位置相对集中，说明这6种储藏条件下的稻谷真菌群落物种多样性差异较小。

图4 原始稻谷及不同条件储藏后稻谷中真菌的PCA图Fig.4 PCA plots of fungal communities in fresh rice and rice stored under different conditions

3 结 论

采用Illumina HiSeq高通量测序技术对原始稻谷与在不同温度、湿度条件下储藏后的稻谷中的真菌多样性和菌群结构进行分析，对OTU进行物种分类后发现，原始稻谷及在不同温度、湿度条件储藏后的稻谷中的真菌群落共计属于6 个门、24 个纲、67 个目、160 个科、285 个属、406 个种。与原始稻谷样品相比，不同温、湿度条件储藏后的稻谷真菌群落组成与丰度均发生了变化。其中优势菌种为B.bassiana、A.flavus和N.oryzae，且随着湿度的升高，A.flavus占比越来越高。因此认为，温度和RH会影响储藏稻谷中的微生物群落，所以湿度和温度控制是水稻贮藏的重要制约因素。较高的RH更有利于某些真菌的发育，并进一步加速了水稻品质劣变。其中A.flavus受湿度影响较大，在85% RH时，相对丰度在各储藏温度下都达到最大，可以认为是影响稻谷品质的关键菌属，A.flavus产生的AFB1会对人体造成极大危害，所以对A.flavus的防控同时可以从源头上降低AFB1发生的可能性。通过Venn分析与PCA，可以发现原始稻谷样品与在不同温度、湿度条件下储藏后的稻谷样品真菌群落中，既具有共有真菌菌种，也具有特有真菌菌种，原始稻谷样品与不同条件储藏后的样品中真菌群落多样性存在较大差异，不同温、湿度条件中的稻谷样品真菌群落多样性之间也存在差异，但20、25、30 ℃下75%和85% RH储藏条件下的稻谷真菌群落多样性之间差异较小。