红曲霉对白霉干酪理化及流变特性的影响

焦晶凯，刘振民，郑远荣，刘 景

（乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术研究中心，上海 200436）

红曲霉（Monascus）的应用在近年来备受关注，红曲霉发酵最为常见的产物即为红曲米，红曲米的应用已经存在了上千年的历史，通常是由红曲霉（紫色红曲霉M.purpureus、丛毛红曲霉M.pilosus、佛罗里达红曲霉M.floridanus、红色红曲霉M.ruber）发酵而成的。此外，红曲霉也被应用在酿酒、制药和食品保护剂等方面。红曲霉可以产生一系列的生物活性物质，并对人体产生有益健康的作用，如洛伐他汀（莫纳克林）[1-2]、红曲酸[3]、异黄酮[4]、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）[5]以及红曲色素[6]。Zhao Yongxia等[7]分离来自红曲霉的麦角固醇，并证实来自红曲的麦角甾醇具有很强的抗脂质过氧化和抗氧化能力，以及保护和修复受损细胞的能力。Su Nanwei等[8]发现红曲霉发酵的红曲米提取物对Hep G2癌细胞具有选择性的细胞毒性作用，诱导癌细胞凋亡，而对正常的细胞无害。Wang Pan等[9]研究发现紫色红曲霉发酵产物可以改善凡纳滨对虾的生长性能、免疫反应、肠道形态、微生物群和抗病性。Wang Nifei等[10]从红曲霉发酵液中提取出对RAW 264.7巨噬细胞具有免疫调节作用的胞外多糖。Choe等[11]研究表明红曲霉色素的苏氨酸衍生物可以减少小鼠体质量、附睾脂肪质量和腹部脂肪大小。

白霉干酪属于表面霉菌成熟软质干酪，它的特点是由于卡门柏青霉（Penicillium camemberti）等青霉菌生长在表面而使表面形成菌丝体，类似包裹一层白色外衣，并赋予干酪特殊的芳香风味。最为典型的白霉干酪即为卡门贝尔干酪，卡门贝尔干酪源自于法国的诺曼底地区，它起源于法国，流传到欧洲国家，再到南美、新西兰和澳大利亚[12]。由于霉菌的引入带来了更强的蛋白水解和脂肪水解作用，从而产生了更多脂肪酸、醛类、酯类和萜烯化合物，使白霉干酪的风味更加的丰富。有学者对表面霉菌干酪的附属发酵剂进行了深一步研究，如通常会加入汉斯德巴氏酵母菌（Debaryomyces hansenii）和马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）改善奶酪的质地[13]；白地霉（Geotrichum candidum）也通常被用来提高卡门贝尔干酪的风味[14]，并成为常规的生产模式商业菌株。

本研究以传统可食用性菌株红曲霉为研究对象，并作为附属发酵剂参与表面成熟白霉干酪的成熟过程，通过测定其基本理化指标、功能性及有害性成分、质构和流变特性等分析红曲霉在软质成熟干酪中的应用价值，并分析红曲霉对这类干酪成熟过程的影响。以期为红曲霉的应用拓展新的方向，同时红曲霉的加入旨在改变表面成熟软质干酪的风味、外观和质地，扩展软质奶酪的新品类。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

PD206746.0FR菌种（主要为卡门柏青霉）、凝乳酶Marzyme 150MG 美国Danisco公司；CHN-22菌种（主要为乳酸乳球菌乳脂亚种（Lactococcus lactissubsp.cremoris）、乳酸乳球菌乳酸亚种（L.lactissubsp.lactis）、乳酸乳球菌双乙酰亚种（L.lactisssp.diacetylactis）、肠膜明串珠菌肠膜亚种（Leuconostoc mesenteroidessubsp.mesenteroides）） 科汉森（中国）有限公司；实验室自筛选菌种红曲霉M.CJ781。

奶酪槽 英国Armfiled公司；Inlab solids pro三合一pH计探头 瑞士METTLER公司；SPECORD紫外分光光度计、ColorFlex EZ色差仪 美国HunterLab公司；TA-Hdi型质构分析仪 英国Stable Micro Systems公司；mb45水分测定仪 美国OHAUS公司；ARES-G2流变仪美国TA仪器公司；Ultimate 3000高效液相色谱 美国赛默飞仪器公司。

1.2 方法

1.2.1 白霉干酪的制备

首先将生牛乳（由光明乳业股份有限公司牧场提供，蛋白2.9%，脂肪3.1%）进行巴氏杀菌，杀菌乳冷却至34～36 ℃后泵送进入奶酪槽，加入主发酵剂CHN-22菌种和附属发酵剂PD206746.0FR菌种，菌种接种量分别为5 U/100 L和0.4 U/100 U，当发酵pH值达到6.4～6.5时加入凝乳酶Marzyme 150MG，使用量为4 000 IMCU/100 L，凝乳30 min后进行切割，切割后间隔缓慢搅拌45～60 min，随后泵入模具，25 ℃条件下过夜，饱和食盐水盐渍1 h。所得干酪置于28 ℃环境下成熟2～3 d，后置于4 ℃环境下成熟25 d。得白霉干酪成熟初始阶段C1干酪样品（发酵第1天）、中期阶段C2干酪样品（发酵第15天）和末期阶段C3干酪样品（发酵第28天）。

1.2.2 红曲霉-白霉干酪的制备

通过从红曲米、腐乳等传统食品中分离筛选出优势红曲霉M.CJ233，该株菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC No.18563。红曲霉M.CJ2330种子液制备：挑取红曲霉菌株，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）培养基中活化，PDA培养基包括马铃薯粉4～6 g/L、葡萄糖18～22 g/L，培养基的pH值为5.4～5.8，随后进行10～20 倍的扩培。红曲霉-白霉干酪的制备方法与1.2.1节白霉干酪的制备基本相同，仅将附属发酵剂PD206746.0FR菌种变为同时加入发酵剂PD206746.0FR菌种和红曲霉M.CJ233种子液。得红曲霉-白霉干酪成熟初始阶段MCC1干酪样品（发酵第1天）、中期阶段MCC2干酪样品（发酵第15天）和末期阶段MCC3干酪样品（发酵第28天）。

1.2.3 干酪的理化测定

pH值测定采用用Inlab solids pro三合一pH计插入干酪样品直接测定。采用mb45水分测定仪测定干酪样品水分含量。蛋白质测定采用AOAC 2001.14[15]；脂肪测定采用AOAC 933.05[16]；总膳食纤维测定采用AOAC 991.43[17]；灰分测定采用AOAC 935.42[18]。色差采用ColorFlex EZ色差仪进行测定；红色素、橙色素和黄色素分别以干酪乙醇提取液在500、470 nm和400 nm波长下的吸光度表示。

1.2.4 感官评价分析

按照Zhao Zheng等[19]的测试方法，根据9 个尺度进行分析，即1-极度不喜欢，9-极度喜欢。向平常有品尝或接触干酪的14 人（8 位男性和10 位女性）分发问卷，以评估总体接受度。

1.2.5 质构特性

干酪的质构分析采用质构仪测定，测量方式为两次下压，模式measure force in compress；测试前速度1.00 mm/s，测试速度1.00 mm/s，测量后探头回程速度5.00 mm/s；测试距离5 mm；探头类型为P/0.5R，每组样品平行测定5 次。

曲线参数及其定义：1）硬度：最大力值以N（g）表示，表示干酪对变形的抵抗能力。2）黏附性：食品表面和其他物体（舌、牙、口腔）附着时，剥离它们所需要的力。3）弹性：表示收到彻底挤压后恢复形变的能力。

1.2.6 流变特性测定

采用ARES-G2流变仪，样品在恒定温度20 ℃下统一测定，04 RAD锥形钛板，平板直径50 mm，间隙1 mm，应变扫描范围为0.01%～10%，动态频率扫描在20 ℃下，根据线性黏弹区所确定的应变值0.1%，GAP设置为1 mm，在0.1～100 rad/s范围内频率扫描，测定储能模量（G’）、损耗模量（G’’）、复合模量（G*）和耗损角tanδ的变化情况。

1.2.7 干酪的功能及有害成分测定

洛伐他汀和橘青霉素测定：使用5 mL 68%的乙醇提取1 g样品，混合1 h，后置于40 ℃水域下保持12 h，2 000×g离心15 min，使用沃特曼1号滤纸过滤上清液并真空蒸干。取1 mL流动相溶解并用0.45 μm膜过滤后上机测试。使用Dionex Ultimate 3000超高性能液相色谱与四极Orbitrap质谱仪联用，在电喷雾离子源模式下进行测定，使用C18柱（180 μm×20 mm，100 Å），用含有0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸铵的甲醇梯度洗脱进行分析，甲醇从2%增加到98%，保持1.5 min，随后在0.5 min内降到2%，并维持2 min达到平衡。

GABA测定：GABA的提取：使用10 mL 75%乙醇溶液提取1 g样品，混合30 min，6 500×g离心10 min。使用沃特曼1号滤纸过滤上清液并真空蒸干，取1 mL流动相溶解并用0.45 μm膜过滤后上机测试。液相色谱-质谱联用方法同洛伐他汀和橘青霉素测定方法。

黄曲霉素测定：采用GB 5009.24—2010《食品中黄曲霉毒素M1和B1的测定》方法。

1.3 数据处理与分析

硬度、黏性、弹性数据利用TA-Hdi型质构分析仪自带软件Exponent进行处理获得。数据结果利用统计分析软件SPSS进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 白霉干酪和红曲霉-白霉干酪的理化指标

如表1所示，红曲霉-白霉干酪的红度值a*为7.81～19.05，显著高于白霉干酪，由图1所示，可以明显看到红曲霉-白霉奶酪的红色素沉淀，这是由于红曲霉在生长过程中可以产生天然的红曲色素，红曲色素是一组通过酯化聚酮生色团和β-酮酸衍生而来的红曲霉代谢产物，具有抗菌、抗肿瘤和抗氧化的作用[20]，Lee等[21]发现红曲色素monascin和ankaflavin可以降低低密度脂蛋白胆固醇并保留和促进高密度脂蛋白胆固醇的形成，由表1也可以看出，红色素、橙色素和黄色素的值在不同发酵阶段也是显著高于白霉干酪；通过感官测试，干酪在发酵初期时比较受欢迎，这与我国本土的饮食文化相关，随着成熟时间的延长，感官评定分数逐渐下降，而可以看出在成熟后，加入红曲霉的干酪风味得到了更多人的接受。

表1 白霉干酪和红曲霉-白霉干酪的理化指标Table 1 Physiochemical parameters of white mold cheese with and without Monascus

图1 红曲霉-白霉干酪Fig.1 White mold cheese with Monascus at the middle and late ripening stages

结果显示，额外添加红曲霉，使奶酪的膳食纤维和蛋白质含量增高，如表1所示，红曲霉-白霉干酪的蛋白质为17.4%～19.6%，膳食纤维为5.22%～6.81%，而白霉干酪的蛋白质为13.8%～16.9%，膳食纤维为3.22%～5.16%，Sun Congcong等[22]也发现红曲霉可以增加豆渣的膳食纤维含量。但是，脂肪并未表现增加，已有学者对红曲霉菌进行研究发现，该菌具有一定降解脂肪的作用，如张茜等[23]研究了20 株红曲霉在含有胆固醇的培养基中生长情况，结果表明，供试的20 株红曲霉均具有降解胆固醇的能力，部分菌株对胆固醇降解率甚至超过50%。Suraiya等[24]研究发现红曲霉提取物可以抑制3T3L-1细胞的成脂分化，经过油红O染色显示细胞胞质油滴呈红曲霉提取物剂量依赖性下降，与对照相比，红曲霉提取物处理的细胞中脂质的积累较低。红曲霉菌产生的洛伐他汀也是公认降脂的主要成分[25]。

2.2 白霉干酪和红曲霉-白霉干酪的理化指标的质构特性

由表2可以看出，红曲霉-白霉干酪在成熟初期和中期，硬度显著高于白霉干酪，而到了成熟期末时，其硬度与白霉干酪硬度无显著差异，白霉干酪的硬度为1 341.52 g，红曲霉-白霉干酪的硬度为1 376.83 g。霉菌生长到一定阶段时会产生蛋白酶，使干酪中的蛋白胶束发生水解，蛋白空间网络结构强度和刚度降低[26]，因此可以解释红曲霉-白霉的硬度在末期逐渐变小，而白霉干酪硬度之所以没有减少，可能原因为白霉干酪的水分损失带来的硬度增加，大于白霉蛋白酶水解带来的硬度减小。红曲霉-白霉干酪的弹性为90.35～92.15，黏性为1 078.47～1 766.82，显著高于白霉干酪，这可能与增加的红曲霉-白霉干酪膳食纤维有关，膳食纤维与持水力非常相关，不仅可溶性膳食纤维和不可溶膳食纤维的比例影响持水力[22]，可溶性膳食纤维颗粒的比表面积增加也会增加持水的能力[27]。加入红曲霉后带来的质构的变化，可能也增加了干酪的可接受程度（如表1感官评定所示）。

表2 不同成熟期软质干酪的质构特性Table 2 Textural properties of soft cheese at different ripening stages

2.3 白霉干酪和红曲霉-白霉干酪的流变特性

如图2所示，G’和G’’随着角频率的增加而缓慢增加，并且G’显著大于G’’说明干酪样品表现出良好的固态弹性，最初成熟阶段，两种奶酪的G’并没有显著差别，随着成熟时间的延长，红曲霉-白霉干酪的G’明显增加，说明额外添加红曲霉之后可以很好地增加干酪的弹性。此外，G’随着干酪成熟时期的延长不断增加，说明随着干酪的成熟，质地趋势渐好。

图2 干酪成熟过程中的流变特性Fig.2 Rheological properties of cheese at different ripening stages

机械损耗角正切（tanδ）是G’’与G’之比，tanδ值越小，说明复配凝胶体系的弹性越大，tanδ值越大则说明复配凝胶体系的黏性越大[28]。红曲霉-白霉成熟末期样品（MCC3）随着角频率的增加，tanδ值的降低斜率最大，说明，此时的MCC3样品的弹性最为良好。

2.4 白霉干酪和红曲霉-白霉干酪的功能及有害成分分析

红曲霉被广泛应用于20多种食品中，而没有对健康产生不利的影响，此外，以红曲霉发酵生产的红曲米被广泛的用于食品、防腐剂、食品着色剂和制药，公认的红曲霉代谢产物具有抗炎、抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤、降血糖和降压等功效[29]。

检测红曲霉-白霉干酪中具有降血脂功效的洛伐他汀和可以缓解疲劳的GABA含量，如图3所示，在红曲霉-白霉干酪中期和末期分别检测到（0.05±0.01）mg/kg和（2.21±0.01）mg/kg洛伐他汀，未加入红曲霉的白霉干酪的并未检测到，众所周知，洛伐他汀是降血脂药物中的主要成分，各种临床实验表明，红曲霉代谢产物红曲米在不耐受常规的他汀类药物的高血脂患者中极为有效，红曲霉干酪是另一种极为有潜力替代红曲米的治疗高血脂患者的食物。

图3 干酪中的橘青霉素、黄曲霉毒素、洛伐他汀和GABA含量Fig.3 Contents of citrinin, aflatoxin, mevinolin and gammaaminobutyric acid in cheese

在所有干酪中均检测到GABA，白霉干酪中的GABA含量为（0.63±0.01）～（1.25±0.07）mg/kg，红曲霉-白霉干酪中的GABA含量为（0.54±0.02）～（0.70±0.01）mg/kg。GABA是交感神经系统中的抑制性神经递质，在一项关于果糖诱导的高血压研究中发现，胃内给服含有GABA（1 mg/（kg·d））的红曲霉发酵产物后，可使血压升高恢复到正常水平，而等计量的纯GABA给药并没有产生作用[29]。红曲白霉干酪中的GABA的作用有待于进一步深入研究。

虽然红曲霉早已广泛应用于人们的生活中，但它所产生的橘青霉素是目前科学家们主要担心会对人体产生危害的物质，橘青霉素是一种真菌毒素，对人体肝脏和肾脏有害。目前国际上关于橘青霉素的限量法规如，日本允许限量为200 μg/kg；2019年欧盟委员会发布2019/1901号条例，修订以红曲霉发酵的大米基食品补充剂中橘青霉素的最高限量从2 000 μg/kg降低到100 μg/kg。通过检测发现，红曲霉发酵的干酪中未检测到黄曲霉素，但存在少量橘青霉素，其含量在100 μg/kg之下，此外除发酵初期橘青霉素含量接近100 μg/kg（可能由发酵剂带入）外，其他样品含量均低于50 μg/kg，远低于商业用途的红曲米中橘青霉素的含量，有学者研究红曲米中橘青霉素在0.28～2 458.80 mg/kg范围不等[30]。橘青霉素的存在给红曲霉相关产品的应用带来了极大限制，目前有很多学者通过科学手段降低橘青霉素的含量，有学者使用三羟基异黄酮[31]、黄酮类化合物[32]、芦丁[33]等化合物诱导抑制，降低了红曲霉产生橘青霉素含量；再有通过改变生长环境如降低pH值、增加极低频磁场等方式抑制橘青霉素的产生；也有学者通过敲除橘青霉素合成相关基因[34]等手段降低橘青霉素的含量。通过这些方式可以帮助更好地提高和控制红曲霉相关产品安全和质量。

3 结 论

本研究分析了红曲霉在牛乳中的发酵特性，并与成熟软质霉菌干酪-白霉干酪进行对比，表征了红曲霉-白霉干酪特性。红曲霉-白霉干酪对比传统白霉干酪，具有天然红曲色素的外观，含有更多的蛋白质和膳食纤维，并在更高含水量的情况下，维持脂肪含量不变。质构和流变特性也加以改善，同时增加了洛伐他汀功能性成分。额外添加红曲霉也增加了干酪的可接受度。结果分析表明，红曲霉可以很好地应用于干酪的生产，并赋予干酪更好的质构特性、更多的活性成分和营养价值，为红曲霉的应用开辟了更广阔的前景，增加了软质成熟干酪附属发酵剂的新品类，为进一步研究适合中国人口味的软质成熟干酪奠定基础。