高通量测序分析混合菌群中的呕吐毒素降解菌

高 慧，牛家峰，杨 华，陆兆新，陈美容，吕凤霞

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

呕吐毒素，也称脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），是产毒镰刀菌等产生的次级代谢产物[1-3]，在谷物及其制品中均有较高的污染率。DON作为一种毒力因子，不仅会加速镰刀菌对谷物的侵染，而且霉变谷物中积累的DON进入食物链后对人、畜都具有潜在危害[4-7]，如引起食欲不振、免疫抑制、恶心、呕吐等。然而各种物理[8-9]和化学方法[10-11]对DON的去除效果并不理想的同时还会对谷物的营养价值造成损失，故生物脱毒法因其绿色安全和高效[12-13]成为当前研究的热点。DON的生物脱毒主要分为两类，一类是利用微生物发酵产生的菌体细胞对DON的吸附作用从而去除谷物及其制品中的DON[14]，另一类是利用微生物代谢产生的酶对DON进行降解。DON分子中的C12,13位的环氧基团是最主要的致毒基团，微生物能够将其脱环氧化生成产物DOM-1[15-17]，毒理学研究表明，DOM-1的毒性极低，基本接近无毒[18]。此外，C3位上的羟基也是DON的主要致毒基团之一，目前研究人员也已从土壤等环境样品中筛选出多种微生物能将DON氧化[19-21]与异构化[22-24]，形成产物3-keto-DON和3-epi-DON，研究表明它们的毒性均比DON低[25]。

虽然降解DON的微生物广泛存在于各种自然环境，但是纯培养物却很难获得。目前DON降解菌株的筛选主要利用实验室条件下的富集培养，在此类方法下，培养基的选择尤为重要。目前采用的筛选培养基主要分为两类，一类是利用营养贫乏的无机盐培养基添加DON为碳源，筛选获得能够利用DON为唯一碳源的菌株；另一类则是利用添加有营养物质的培养基进行富集培养，同时检测培养基中的DON降解情况，如He Jianwei等[26]采用CMB培养基分离得到德沃斯氏菌17-2-E-8。当利用无机盐培养基进行筛选时，因营养匮乏可能会导致某些DON降解菌不能生长，而采用营养丰富的培养基，混合菌群中不具有DON降解能力的优势微生物又会抑制DON降解菌的生长，这些都导致了DON降解菌筛选的困难。部分研究人员选择结合原位富集对自然环境中的DON降解菌进行富集，再于实验室条件下筛选，如Zhai Yaoyao等[27]在土壤中长时间定期添加DON增加土壤中的DON降解菌的种类及丰度，然后再于实验室条件下富集培养，获得混合菌群LZ-N1。此外，高通量测序方法也被用于DON降解菌株的筛选，如He Weijie等[28]采用原位富集法获得DON降解混合菌群PGC-3后，并结合聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳和高通量测序分析不同DON浓度或添加不同抗生素条件下的微生物多样性变化，推测混合菌群中的主要DON降解菌种。但基于高通量筛选方法分析混合菌群中不同稀释倍数间的DON降解效果差异和菌种差异的研究鲜见报道。

本研究首先用以DON为唯一碳源的无机盐培养基对土壤进行3 轮筛选，降低土壤中不具有DON降解能力的微生物的种类。然后在无机盐培养基中外加氮源对DON降解菌进行富集培养，筛选到一种能够完全降解DON的混合菌群LG-6-7，并且利用高通量测序方法对该混合菌群不同稀释倍数间的微生物多样性进行分析，从而推测混合菌群中的主要DON降解菌。最后，对该混合菌群进行分离纯化，并对降解菌的降解特性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

采集自全国不同地区的土壤样品见表1，采自距离地表10～15 cm处的土壤，采集时间2019年2—4月。

表1 实验采集土壤样品来源Table 1 Sources of soil samples collected in this study

1.1.2 培养基

MM（无机盐）培养基：Na2HPO4·12H2O 1.6 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、NaNO30.5 g/L、(NH4)2SO40.05 g/L、CaCl20.025 g/L；MMT培养基：MM＋蛋白胨2 g/L；MMY培养基：MM＋酵母提取物2 g/L；MMG：MM＋葡萄糖2 g/L；MM＋sucrose：MM＋蔗糖2 g/L；LB培养基：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L；100 d LB培养基：100 倍稀释的LB培养基；NB培养基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化钠5 g/L；100 d NB培养基：100 倍稀释的NB培养基。

1.1.3 试剂

DON标准品 加拿大TripleBond公司；甲醇、无水乙醇（均为色谱级） 国药集团化学试剂有限公司；液氮、盐酸、吡咯喹啉醌、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 南京辉亚生物科技公司。

1.2 仪器与设备

Ultrimate 3000高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC） 上海赛默飞世尔科技有限公司；DRP-9162型电热恒温培养箱 上海森信实验仪器有限公司；HYL-A型全温摇瓶柜 太仓市强乐实验仪器有限公司；Centrifuge 5804R型高速离心机 德国Eppendorf公司；SW-CJ-1FD洁净工作台 苏州净化设备有限公司；BCD-539WT海尔医用低温保存箱 青岛海尔特种电器有限公司；LS-50HD型立式压力蒸汽灭菌器美国Tomy公司。

1.3 方法

1.3.1 土壤微生物的富集培养

取5 g土壤用20 mL无菌水悬浮，置于180 r/min、37 ℃条件下混匀4 h，取土壤悬浮液200 μL接种于MM培养基（含20 μg/mL DON）中，37 ℃、180 r/min条件下富集培养7 d，以灭菌后的土壤悬浮液作为对照排除土壤对DON的吸附作用，HPLC检测土壤样品的DON降解效果，将土壤在以DON为唯一碳源的MM培养基中传代培养3 次，获得具有DON降解活性的土壤样品。

取具有DON降解活性的土壤样品200 μL，接种到添加不同碳氮源的无机盐培养基中连续传代培养，获得能在连续传代中保持稳定降解活性的土壤微生物群落。

1.3.2 混合菌群不同稀释倍数的降解能力

将混合菌群LG-6梯度稀释至10－1～10－10后，接种以及涂布到MMT液体和固体培养基上，置于37 ℃恒温培养箱中培养72 h，HPLC检测不同稀释倍数混合菌群降解DON的效果，同时从具有DON降解活性的稀释梯度对应的涂布平板上挑选单菌落，接种于MMT液体培养基中培养并检测其DON降解效果。

1.3.3 混合菌群微生物多样性分析

将混合菌群LG-6梯度稀释至10－7和10－8后接种于新鲜的MMT液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养48 h后，8 000 r/min、4 ℃离心10 min收集菌体，采用液氮速冻后保存于－80 ℃超低温冰箱中，送往上海美吉生物公司进行高通量测序，对混合菌群中的微生物组成进行分析。

1.3.4 DON降解菌的分离纯化

将混合菌群LG-6-7稀释涂布平板上不同形态的单菌落挑选出来，接种于MMT液体培养基中，置于37 ℃、180 r/min条件下培养48 h。提取细菌基因组DNA，使用细菌16S rDNA通用引物进行基因扩增，通用引物为上游引物27 F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、下游引物1492 R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。扩增产物由上海生工生物技术有限公司进行测序。

利用BLAST搜索法鉴定与分离菌株16S rDNA基因相似度（＞97%）的序列，根据微生物多样性分析结果，将分离出的不同单菌落于MMT液体培养基（DON质量浓度50 μg/mL）中进行混合培养，获得能够对DON进行降解的纯培养物，并使用MEGA软件构建DON降解菌的系统发育树。

1.3.5 假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243对DON的降解

将假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群按2%接种量接种于以下条件：培养温度16、20、25、30、37、42 ℃，培养基pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，培养基MM、MMT、MMY、MM＋sucrose、NB、100 d NB、LB、100 d LB。当其中一个因素发生变化时，其他因素固定在37 ℃、pH 7.0、MMT培养基。180 r/min培养72 h后，HPLC检测培养基中的DON降解情况。

1.3.6 假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243的微生物生长及其与DON的降解关系

将假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群按2%接种量接种至MMT中，DON质量浓度为50 μg/mL，培养48 h后按2%接种量接种至MMT培养基中，置于37 ℃、180 r/min条件下培养，每隔12 h取样测定其OD600nm以及DON质量浓度，绘制微生物生长与DON降解效果之间的曲线。

1.3.7 假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243的发酵上清液、细胞破碎液以及细胞碎片对DON的降解效果

将假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群按2%接种量接种于MMT液体培养基中，37 ℃、180 r/min条件下培养48 h，发酵液于4 ℃、8 000 r/min离心10 min，取上清液过2 次0.22 μm无菌滤膜得到发酵上清液。细胞沉淀重悬于pH 7.0的磷酸盐缓冲液中采用超声破碎（400 W，工作5 s，间歇5 s），破碎液在4 ℃、8 000 r/min离心30 min，上清液即为细胞破碎液（过2 次0.22 μm无菌滤膜），沉淀即为细胞碎片。将未处理的发酵上清液、细胞破碎液、细胞碎片以及煮沸10 min处理的上清液、细胞破碎液、细胞碎片分别与DON在37 ℃条件下反应不同时间，加入酸化甲醇中止反应，HPLC检测反应不同时间下反应体系中的DON降解效果。

1.3.8 DON降解率的测定

1.3.8.1 DON标准曲线的建立

HPLC条件：反相C18色谱柱（250 mm×4.6 mm），流动相为甲醇-水（30∶70，V/V），流速为0.6 mL/min，检测波长218 nm，进样量20 μL，柱温30 ℃。

用去离子水配制0、12.5、25、50、75、100 μg/mL的DON标准品溶液，HPLC检测，建立DON的峰面积与质量浓度之间的一元线性回归方程。DON标准曲线方程为y=0.280 2x－0.161 7，相关系数为0.999 1，表明DON质量浓度在0～100 μg/mL范围内，与对应的峰面积之间具有良好的线性关系。

1.3.8.2 DON降解率的计算

DON降解率按下式计算：

式中：C0为对照组DON质量浓度/（μg/mL）；C为实验组DON质量浓度/（μg/mL）。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 土壤的富集培养

土壤样品经过MM培养基的3 轮富集筛选，发现来自山西省太原市种植黄豆的土壤样品可以在7 d内完全降解MM培养基中的DON，而灭菌后的土壤悬浮液不具备降解DON的效果，故排除土壤对DON的吸附作用。

随后，将此活性土壤样品转接入含有不同碳氮源的无机盐培养基中。如图1所示，土壤样品在添加蛋白胨、酵母提取物和蔗糖的MM培养基中降解率均为100%，在MM培养基中的DON降解率为94%。而在添加葡萄糖的无机盐培养基中，土壤样品不能降解DON。经过在培养基中连续传代培养，获得混合菌群LG-6能够稳定高效降解MMT培养基中的DON，HPLC检测图谱如图2所示。保留时间为10 min左右的吸收峰为DON的吸收峰，当培养72 h后，DON峰完全消失，表示DON被完全降解。

图1 土壤样品在不同培养基中培养7 d的DON降解效果Fig.1 Degradation efficiency of DON in soil samples cultured in different media for 7 days

图2 混合菌群LG-6培养时的HPLC图Fig.2 HPLC profiles of culture medium with bacterial consortium LG-6 before and after culture for 72 h

采用合适的富集培养基可以为DON降解菌提供有利的生长条件，降低DON降解菌筛选与分离的困难。由图1可见，混合菌群LG-6在不同培养基中培养时，其降解DON的效果有所差异，添加葡萄糖时，可能因葡萄糖不利于混合菌群中DON降解菌的生长或葡萄糖对DON的降解产生抑制而使混合菌群LG-6的DON降解活性丢失[29-31]，而在添加特定碳氮源的MM培养基中其DON降解率达到100%。经过连续传代培养，混合菌群LG-6在MMT培养基中降解DON的能力最稳定，所以选择MMT培养基作为其富集培养基。

2.2 混合菌群不同稀释倍数的DON降解能力

经过对混合菌群进行梯度稀释，发现不同稀释倍数混合菌群之间的DON降解效果具有明显差异，结果如图3所示。当混合菌群稀释至10－7时，混合菌群传代培养仍然保持DON降解率为100%，而当其稀释至10－8时传代培养，其DON降解活性完全丢失。因为从混合菌群LG-6稀释至10－7后的涂布平板上并未挑选到具有降解DON能力的单菌落，所以猜测混合菌群LG-6对DON的降解不是单一菌种的作用，而是多种微生物之间的共同作用。稀释至10－7的混合菌群LG-6-7和稀释至10－8的混合菌群LG-6-8之间DON降解效果的差异可能是因为在梯度稀释过程中DON降解菌发生丢失，故其中丢失的菌种或与混合菌群降解DON的能力有关。

图3 稀释倍数对混合菌群LG-6降解DON的影响Fig.3 Effects of dilution ratio on DON degradation by bacterial consortium LG-6

2.3 混合菌群LG-6-7和混合菌群LG-6-8的微生物多样性分析

将这2 个不同稀释倍数的混合菌群传代培养后进行微生物多样性检测，采用美吉生物云平台对稀释至10－7的混合菌群LG-6-7和稀释至10－8的混合菌群LG-6-8的微生物组成进行分析，结果如图4所示。当稀释至10－7时，其微生物组成为德沃斯氏菌属（Devosia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、代尔夫特菌属（Delftia）、节细菌属（Arthrobacter）和假苍白杆菌属（Pseudochrobactrum）；稀释至10－8时，其微生物组成为节细菌属（Arthrobacter）和假苍白杆菌属（Pseudochrobactrum）。由此可见，2 个不同稀释倍数间的差异菌种即为假单胞菌属、德沃斯氏菌属和代尔夫特菌属，即混合菌群LG-6-7中起到DON降解主要作用的菌种可能为假单胞菌属、德沃斯氏菌属和代尔夫特菌属，但是因为是多菌种共同对DON进行降解，导致无法分离到具有DON降解能力的单一菌落。

图4 混合菌群LG-6两个不同稀释倍数间的菌群种类差异Fig.4 Difference in species composition between two dilution ratios of bacterial consortium LG-6

2.4 混合菌群LG-6-7中DON降解菌的分离纯化

从混合菌群LG-6-7稀释涂布平板上分离纯化出全部不同形态的单菌落，对其16S rDNA序列进行扩增测序。通过序列比对，发现从平板上分离纯化出的单菌落包括以下5种：A6-243与Devosiasp.strain M6-77的相似性为98.28%、B6-24与Pseudomonas resinovoransstrain S7的相似性为98.01%、C6-1与Delftia tsuruhatensisstrain D9的相似性为97%、D6-2与Arthrobactersp.MR-17的相似性为98.21%、E6-3与Pseudochrobactrumsp.strain OD42的相似性为95.97%。即混合菌群LG-6-7分离纯化出的菌落与微生物多样性测序结果一致，包括德沃斯氏菌属、假单胞菌属、代尔夫特菌属（Delftia）、节细菌属和假苍白杆菌属。

根据微生物多样性分析推测结果，将德沃斯氏菌A6-243、假单胞菌B6-24和代尔夫特菌C6-1混合培养发现其能够完全降解培养基种的DON。同时，将这3种菌两两混合，发现德沃斯氏菌A6-243和假单胞菌B6-24混合培养能够完全降解培养基中的DON，而单独培养时没有降解DON的能力。因此混合菌群LG-6-7中的DON降解菌为假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243，其系统发育树如图5所示。值得注意的是，有研究表明德沃斯氏菌属中一部分菌种不具有单独降解DON的能力，而一小部分德沃斯氏菌属可以单独降解DON，例如，从土壤中筛选到的德沃斯氏菌17-2-E-8、德沃斯氏菌D6-9等[24,26]。假单胞菌属也曾在DON降解菌中筛选到，如从混合菌群LZ-N1中分离得到的假单胞菌Y1与溶杆菌S1混合培养具有降解DON的能力[27]。

图5 假单胞菌属B6-24与德沃斯氏菌属A6-243系统发育树Fig.5 Phylogenetic trees of Pseudomonas sp.B6-24 and Devosia A6-243

2.5 假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群的DON降解特性

为了研究假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群的DON降解特性，测定不同温度、pH值和培养基条件下的DON降解效果，结果如图6所示。在16～37 ℃范围内，混合菌群在72 h内能够完全降解培养基中的DON，而在42 ℃条件下，DON降解率仅为21%。在pH 5.0～10.0的较宽范围内，混合菌群均可以降解DON，在pH 7.0～8.0时，降解效果保持在100%。而在较酸和较碱条件下培养时，DON降解率在84%～98%之间。混合培养物在100 d NB、100 d LB、MMT、MMY、MM＋sucrose培养基中的DON降解率为100%，而在LB、NB和MM培养基中DON降解效果有所下降，降解率只有70%～98%。

图6 培养条件对假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群降解DON效果的影响Fig.6 Effects of culture conditions on DON degradation by mixed culture of Pseudomonas sp.B6-24 and Devosia A6-243

由结果可知，较高温度和较酸较碱的pH值对假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群的DON降解效果均有影响。同时此混合菌群在以DON为唯一碳源的无机盐培养基和含有碳氮源的培养基中都能生长并降解DON，但是在添加碳氮源的培养基中DON降解率更高，说明添加合适的碳氮源更加有利于混合菌群对DON的降解。

2.6 假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群的微生物生长与对DON降解

如图7所示，此混合培养物在48 h内能够完全降解培养基中的DON，混合菌群LG-6-7生长对数期主要为0～24 h，而DON的降解也主要发生在这一时期，由此可见，假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群对DON的降解随着菌体量的增多开始。

图7 假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群的生长曲线以及DON质量浓度变化Fig.7 DON degradation and growth profiles of mixed culture of Pseudomonas sp.B6-24 and Devosia A6-243

2.7 假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群发酵上清液、细胞破碎液以及细胞碎片对DON的降解效果

为探究混合培养物是否为酶的作用以及降解酶在微生物体内存在的部位，研究未处理以及热灭活处理的混合培养物发酵上清液、细胞破碎液以及细胞碎片对DON的降解作用，结果如图8所示。未经处理的细胞破碎液以及细胞碎片可以在48 h内完全降解DON，而发酵上清液和热灭活的处理组不能降解DON，说明细胞破碎液以及细胞碎片起到降解DON的作用。即假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群对DON的降解为酶的作用，且降解酶主要存在于胞内。

图8 混合菌群发酵上清液、细胞破碎液以及细胞碎片与DON孵育不同时间DON质量浓度变化Fig.8 Changes in concentration of DON in supernatant, lysate and cell debris of mixed culture of Pseudomonas sp.B6-24 and Devosia A6-243 incubated with DON for different periods of time

3 结 论

本研究通过实验室条件下的富集培养，从土壤中筛选到能够降解DON的混合菌群LG-6-7，并通过比较不同稀释倍数间的微生物菌落组成的差异，推测出混合菌群LG-6中对DON起主要降解作用的可能为假单胞菌B6-24、德沃斯氏菌A6-243和代尔夫特菌C6-1。将混合菌群LG-6-7中的菌落进行分离纯化，并根据微生物多样性分析结果，将不同的单一菌株混合培养，发现假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合培养时可以在48 h内完全降解DON。同时，对假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群的降解特性进行研究，确定该混合菌群培养温度为37 ℃、pH 7.0，培养基为MMT培养基，培养48 h内完全降解培养基中的DON。并通过对该混合菌群发酵上清液、细胞破碎液及细胞碎片的DON降解效果进行研究，发现该混合菌群是通过微生物代谢产生的酶对DON进行降解，且DON的降解酶主要存在于胞内。本研究基于高通量测序分析混合菌群中不同稀释倍数间菌种差异的方法及对混合菌群降解特性的研究，将为DON降解菌的筛选以及降解途径的研究提供依据。