发酵对山黑猪肉干品质特性的影响

周亚军，王 宁，陈 艳，张 玉，王淑杰

（1.吉林大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130062；2.吉林大学生物与农业工程学院，吉林 长春 130022）

由于传统的饮食习惯，我国是猪肉生产和消费大国。国家统计局历年统计数据显示，2013—2018年我国肉总产量基本维持在8 500万 t，其中猪肉产量占比60%以上。随着人们健康生活意识的提高，对高品质猪肉的需求也随之增加。但因为工厂化白猪过分要求猪的饲料转化率、生长速率等，忽略消费者对高品质猪肉的需求。吉林山黑猪是将北京黑猪和大约克夏猪杂交育种，历经20 年培育出的优质瘦肉型黑猪品种。与工厂白猪相比，不仅生长速度快、经济效益好，还具有高谷氨酸、高不饱和脂肪酸、低胆固醇、风味浓郁、脂肪沉积性好等特点[1]。周慧敏等[2]研究发现与普通瘦肉型猪肉相比山黑猪肉味风味更为浓郁，己醛、辛醛等5种醛类和苯乙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮2种酮类是形成2种猪肉风味差异的主要原因。目前山黑猪年出栏量可达20万 头，可部分填补国内高品质猪肉市场，深受消费者欢迎。

肉干是经过腌制、干燥等工艺加工而成的传统肉制品，因其蛋白质含量高、易携带、方便贮存等特点受到人们的喜爱。肉干传统工艺制作中会经过较长时间干燥，存在产品口感较硬、咀嚼性较差、色泽不佳等现象。添加外源发酵剂制成的发酵肉干，在微生物的作用下可以改善肉干的质地、形成独特风味和提高消化率，还可以抑制有害微生物生长和氧化、降低亚硝酸盐残留量和有害生物胺含量[3-4]。目前，对吉林山黑猪研究主要集中在猪肉品质[1-2]，其发酵制品研究较少，仅张海杰[5]以山黑猪肉为原料开发新型发酵火腿，山黑猪肉干发酵过程中发酵特性研究鲜见报道。本研究以山黑猪肉为原料，添加发酵剂制作发酵肉干，研究不同发酵因素对肉干发酵过程中发酵特性的影响，旨在为山黑猪肉制品的开发提供借鉴参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪后臀肉 吉林精气神有机农业股份有限公司；木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus，CICC 21445，具有蛋白酶活性）、清酒乳杆菌清酒亚种（Lactobacillus sakeisubsp.sakei，CICC 21858） 中国工业微生物菌种保藏中心。

1.2 仪器与设备

HD-3A型智能水分活度测量仪 北京西化仪科技有限公司；WSF色差仪 上海仪电物理光学仪器有限公司；JY600c系列电泳仪 北京君意东方电泳设备有限公司；UV-8000S紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；H2-16KR台式高速冷冻离心机 湖南可成仪器设备有限公司；CT3质构仪 美国Brookfield公司。

1.3 方法

1.3.1 腌制配方

葡萄糖l%、食盐2%、蔗糖l%、亚硝酸钠0.015%、胡椒粉0.35%、料酒2.4%，各物质添加量均按肉质量百分比添加。

1.3.2 工艺流程与操作要点

工艺流程：原料肉处理→腌制→接种→发酵→干燥→包装→终产品。

原料肉预处理：山黑猪后臀肉剔除脂肪、筋膜等杂质部分，清水冲洗干净后沸水煮制10 min，沿猪肉纹理分割成6 cm×2 cm×2 cm的肉块。

腌制：将腌制料按肉质量百分比加入修整好的肉块中，混合均匀，4 ℃腌制24 h。

发酵：腌制完成后，按一定配比和接种量将发酵剂添加到肉中恒温培养。

干燥：60 ℃干燥3 h，90 ℃干燥1 h，为保持受热均匀和防止黏连，每30 min翻面一次。

包装：干燥后的样品冷却至室温，真空包装。

1.3.3 发酵条件对山黑猪肉干发酵特性影响

进行单因素试验时，各因素基本水平为发酵温度35 ℃，接种量107CFU/g，菌种配比木糖葡萄球菌（S.xylosus）∶清酒乳杆菌清酒亚种（L.sakei）=1∶1，发酵时间32 h，试验设计如表1所示。

表1 单因素试验因素与水平Table 1 Coded levels of independent variables

1.3.4 指标测定

1.3.4.1 pH值

参照GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》进行测定。

1.3.4.2 水分活度

采用水分活度仪测定。

1.3.4.3 总游离氨基酸（free amino acids，FAAs）

参照茚三酮比色法[6]测定。

1.3.4.4 组胺含量

参照王新惠等[7]的方法测定组胺含量，并根据下式计算：

式中：X为试样中组胺含量/（mg/100 g）；m1为试样中组胺吸光度对应的组胺质量/μg；V1为三氯乙酸体积/mL；m2为取样量/g。

1.3.4.5 亚硝酸残留量

参照GB 5009.33—2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》盐酸萘乙二胺法测定。

1.3.4.6 质构

将山黑猪肉样品沿垂直肌原纤维方向切成1 cm×1 cm×1 cm的肉块，CT3质构仪测定其硬度、弹性和咀嚼性。参数设置为：测试模式TPA，探头TA39，目标形变值50%，测试速率1.00 mm/s，触发点负载0.5 N，循环次数2 次。

1.3.4.7 色泽

发酵山黑猪肉干搅碎后均匀铺设于样品池，WSF色差仪测定样品的亮度（L*）、红度（a*）和黄度（b*），顺时针旋转120°（3 次）得到3 组数据，取平均值。

1.3.4.8 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

参考Zhou Yajun等[8]方法进行测定。取2 g发酵山黑猪肉样品，加入20 mL蛋白提取液，均质2 min后，4 ℃、8 500 r/min离心30 min。双缩脲法测定总蛋白质量浓度，并用1 mol/L的Tris-HCl溶液（pH 7.0）调节蛋白质量浓度至（3.0±0.5）mg/mL。分离胶为10.5%，浓缩胶为4%。电压初始值为80 V，样品进入分离胶后调整为120 V，指示剂移至距胶下端1 cm处停止。染色液染色，再用脱色液脱色至条带清晰，扫描成像。

1.3.4.9 感官评分

邀请10 名食品专业学生，男女各5 名，接受培训后严格按照感官评分标准对山黑猪发酵肉干色泽、滋味、气味、质地4 个方面进行评分，感官评定标准见表2。结果取平均值，保留一位小数。

表2 感官评定标准Table 2 Criteria for sensory evaluation of fermented pork jerky

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 发酵条件对山黑猪肉发酵中pH值的影响

发酵过程中pH值的快速降低有助于抑制有害菌生长，保证食品的安全性，同时低pH值促进亚硝基肌红蛋白生成，赋予产品良好的色泽。由图1A可知，不同配比组pH值随发酵时间延长呈下降趋势。1∶3组下降速度最快，3∶1组和2∶1组下降缓慢，可能是由于乳酸菌产酸能力强于木糖葡萄球菌，乳酸菌占比越大pH值下降越快。2∶1和3∶1组发酵24 h和32 h，pH值无显著差异（P＞0.05）。可能是因为随发酵时间延长，产酸速度减缓，在木糖葡萄球菌蛋白酶的作用下，蛋白质酶解产生的小肽、氨基酸和胺等物质对酸起到缓冲作用[9]。由图1B可知，在发酵前16 h内，pH值下降速度随接种量增大而加快，王志威等[10]在发酵鹅肉香肠研究中也得到相似结论。在乳酸菌消耗碳源产生有机酸和其他微生物代谢的作用下，pH值迅速下降。但发酵16～32 h，接种量为108CFU/g组pH值下降速度逐渐变缓，且最终值小于5×107CFU/g组。可能是因为接种量过大，营养物质缺乏抑制了发酵剂菌株的生长。由图1C可知，0～8 h所有组pH值下降平缓，8～16 h，35 ℃和40 ℃组pH值下降速率远大于其他3 组且45 ℃组下降最慢，这可能是由于温度过高抑制乳酸菌活性。丁希等[11]也发现35 ℃时发酵灌肠pH值最低。

图1 发酵条件对山黑猪肉发酵中pH值的影响Fig.1 Effect of fermentation conditions on pH of pork jerky during fermentation

2.2 发酵条件对山黑猪肉发酵中aw的影响

由图2A可知，不同菌种配比导致aw呈现2种下降趋势，2∶1和3∶1组下降速度先慢后快，1∶1、1∶2和1∶3组下降速度先快后慢。周慧敏等[12]研究表明葡萄球菌对aw影响较小，产酸能力弱，葡萄球菌占比越大，发酵前期pH值下降较慢，后期在乳酸菌的作用下形成酸性环境，加快aw值降低。乳酸菌占比越大，发酵前期pH值快速降低诱导蛋白质变性，持水力降低[13]，有利于aw的减小。另外，谢爱英等[14]在研究发酵香肠发酵过程中也发现aw和pH值呈正相关，pH值降低，aw减小。由图2B可知，108CFU/g组在0～24 h，随发酵时间延长aw下降最快，但最终值大于5×107CFU/g组。接种量小于5×107CFU/g时，随接种量增大最终aw值减小。黄俊逸等[15]研究表明，接种量越大，aw下降速度越快且最终值越低。实验结果不一致可能与接种量大小设置不同有关，当接种量大于5×107CFU/g时，营养物质不充足限制发酵菌种的生长。由图2C可知，实验各组aw均随发酵时间延长呈下降趋势，不同温度条件下降趋势各不相同。35 ℃组在发酵结束时aw值最低，可能是由于35 ℃为发酵菌种适生长温度，快速产酸，pH值接近蛋白质等电点促进蛋白质凝胶化，降低持水力[16]。

图2 发酵条件对山黑猪肉发酵中aw的影响Fig.2 Effect of fermentation conditions on aw of pork jerky during fermentation

2.3 发酵条件对山黑猪肉发酵中FAAs的影响

发酵肉制品中，肉内源酶和微生物外源酶的共同作用使蛋白质和多肽分解为小肽和FAAs，FAAs是发酵肉制品滋味形成的重要组成部分，还是许多挥发性化合物的前体，间接影响产品典型香气的形成，所以FAAs含量对产品风味形成至关重要。由图3A可知，所有组发酵32 h FAAs含量显著大于发酵0 h（P＜0.05），2∶1和3∶1组由于木糖葡萄球菌含量较大，木糖葡萄球菌生长过程中分泌蛋白酶，加速蛋白质分解，因此3∶1组上升趋势最显著且终值最高。薛菲等[17]在研究不同发酵剂对兔肉脯FAAs的影响中得到类似结果。1∶1、1∶2和1∶3组发酵前期FAAs含量增长显著，可能由于乳酸菌本身对蛋白质具有一定分解能力，同时可以通过快速产酸降低pH值至5.0左右，激活肉中内源组织蛋白酶，促进FAAs的产生[18]。发酵后期FAAs含量基本停止上升可能是因为发酵环境pH值过低，抑制内源组织蛋白酶和木糖葡萄球菌的活性。由图3B可知，接种量小于108CFU/g时，FAAs含量在发酵前24 h随接种量增大而增大。发酵时间大于24 h，108CFU/g组出现降低趋势，可能是由于随发酵时间延长，菌体浓度过大，营养物质不充分导致前期产生的FAAs被重新利用[19]。由图3C可知，所有组FAAs含量在发酵过程中均呈上升趋势，发酵32 h时不同温度间含量差异显著（P＜0.05）。蛋白质降解受pH值、温度和盐含量等多方面因素影响。30 ℃组发酵32 h，FAAs含量远大于其他组，其他组可能因为pH值过低抑制蛋白酶活性[20]，或者温度过低或过高抑制发酵菌种活性导致FAAs含量降低。

图3 发酵条件对山黑猪肉发酵中FAAs含量的影响Fig.3 Effect of fermentation conditions on total free amino acid content of pork jerky during fermentation

2.4 发酵条件对山黑猪肉发酵中组胺含量的影响

组胺作为食品中毒性最强的胺，摄入过多会导致恶心、呕吐和头痛等症状。由图4A可知，1∶2和1∶3组组胺含量在发酵期间增长速率缓慢。组胺含量主要和肠杆菌相关[21]，乳酸菌占比较大消耗碳水化合物快速产酸，降低pH值抑制产胺菌生长，从而控制组胺含量增长。2∶1和3∶1组的组胺含量先缓慢上升再迅速增长。有研究表明木糖葡萄球菌可以分泌胺氧化酶，将生物胺分解成过氧化氢、醛和氨等，减少组胺积累[22]。24 h前缓慢上升可能因为木糖葡萄球菌占比较大，减少组胺积累。24 h后由于有机酸的不断积累，低pH值抑制了胺氧化酶的活性[23]，组胺含量上升。由图4B可知，组胺含量随发酵时间延长而增大，接种量越大，组胺含量增长越缓慢，可能是因为接种量增大促进发酵菌种迅速占领发酵优势，抑制产胺菌生长。由图4C可知，45 ℃和25 ℃组最终值较高。研究表明温度通过影响发酵环境中微生物种类、数量、蛋白酶和氨基酸脱羧酶活性控制组胺含量[24]。25 ℃是组氨酸脱羧酶活性较高且稳定的温度[25]，加速组胺形成。45 ℃组组胺含量高可能是由于温度较高导致发酵菌种不能快速占据主导地位，无法有效抑制组氨酸脱羧酶阳性菌的生长。

图4 发酵条件对山黑猪肉发酵中组胺含量的影响Fig.4 Effect of fermentation conditions on histamine content of pork jerky during fermentation

2.5 发酵条件对山黑猪肉发酵中亚硝酸盐残留的影响

亚硝酸盐摄入人体后易与仲胺类物质反应生成亚硝胺而致癌，因此亚硝酸盐残留量是肉制品重要的安全问题。由图5A可知，不同的菌种配比表现出不同趋势。1∶1、1∶2和1∶3组在0～8 h缓慢下降，2∶1和3∶1组亚硝酸残留量0～8 h不减反增，可能是2∶1和3∶1组木糖葡萄球菌比例较大，在木糖葡萄球菌硝酸还原酶的作用下硝酸盐被还原为亚硝酸盐；随着发酵时间延长至8～16 h，乳酸大量积累，pH值降低，抑制硝酸还原酶活性，减少亚硝酸盐形成，同时酸性条件下发生非酶歧化反应形成NO，与肌红蛋白结合促进色泽形成，也降低了亚硝酸盐残留量[26]。由图5B可知，发酵32 h随接种量增大，亚硝酸盐残留量降低，这与郭丹等[27]研究结果一致。有研究表明乳酸菌降解亚硝酸盐可分为2 个阶段，pH值大于4.5时降解以酶的作用为主，pH值小于4.5时酶活性被抑制，以酸降解为主，酶降解速率低于酸降解速率[28]。因此随接种量增大，产酸速率逐渐加快，亚硝酸盐降解速率加快，含量降低。由图5C可知，在不同温度发酵山黑猪肉中，亚硝酸盐残留量随发酵时间呈下降趋势。在发酵温度低于40 ℃时，亚硝酸盐残留量随温度升高而降低。可能是因为40 ℃以下，随温度升高逐渐达到乳酸菌适宜生长温度，快速产酸导致pH值下降，亚硝酸盐发生酸降解[29]，45 ℃组因温度过高抑制乳酸菌的生长，产酸速率慢导致亚硝酸盐残留量下降速度慢且最终值高于其他组。刘玉等[30]研究表明发酵温度为35 ℃时，发酵鱼糜中亚硝酸盐残留量最低。

图5 发酵条件对山黑猪肉发酵中亚硝酸盐残留量的影响Fig.5 Effects of fermentation conditions on nitrite residue of pork jerky during fermentation process

2.6 发酵条件对山黑猪肉发酵后质构特性的影响

质构受食品组成成分、结构和状态的影响，是食品结构与材料性质的感官体现。由图6A可知，1∶3组硬度和咀嚼性最大，弹性最小，这可能与乳酸菌占比较大有关。韦诚等[31]在对酸肉研究时发现硬度、咀嚼性和pH值呈负相关，与乳酸菌数呈正相关，并解释发酵产酸促进蛋白酸凝胶化或变性，硬度增大。3∶1组硬度和咀嚼性最小，可能是由于3∶1组木糖葡萄球菌占比大，蛋白酶活性较高，同时乳酸菌产酸激发肉内源蛋白酶活性，加速肌原纤维蛋白和肌浆蛋白分解[32]，改变肌肉质地。由图6B可知，随着接种量增大，硬度、咀嚼性逐渐增大，弹性下降，王亚男[33]在对牛肉鸡肉混合肉糜发酵特性研究时得到相似结果，可能是因为随接种量增大产酸速率加快，由蛋白质变性和脱水的共同作用所导致。由图6C可知，随温度升高，硬度和咀嚼性先增大后减小，弹性变化不明显。与石江涛[34]研究结果相似，35 ℃接近乳酸菌适宜生长温度，快速产酸，低pH值环境诱导蛋白质变性，持水力下降。

图6 发酵条件对山黑猪肉发酵后质构特性的影响Fig.6 Effect of fermentation conditions on texture properties of pork jerky

2.7 发酵条件对山黑猪肉发酵后色泽的影响

色泽是发酵肉制品重要的感官品质，良好的色泽可以激发消费者的购买欲望。由图7A可知，3∶1组a*和L*最大，1∶3组a*和L*最小。可能是木糖葡萄球菌具有较强的硝酸盐还原酶和过氧化氢酶活性，促进亚硝基肌红蛋白形成，a*增大[35]。L*增大可能是因为木糖葡萄球菌蛋白酶和肉内源酶导致肌纤维松散，使光的散射和穿透发生改变，肉色变亮[36]。由图7B可知，发酵32 h随接种量增大，a*逐渐增大，L*逐渐下降，b*无显著差异（P＞0.05）。Bosse等[37]研究发现，随木糖葡萄球菌菌体浓度增大，硝酸盐还原酶活性增强，亚硝基肌红蛋白含量上升导致a*增大。另外，接种量增大，pH值快速降低。陈曦等[38]在香肠加工中发现低pH值加速水分的散失，L*逐渐下降。由图7C可知，发酵32 h随温度升高，a*和L*先上升后下降，b*逐渐下降。可能是因为木糖葡萄球菌硝酸盐还原酶活性在25～30 ℃随温度升高，活性增强，NO3－被还原为NO2－，再发生化学反应还原为NO，与肌红蛋白结合生成亚硝基肌红蛋白[39]。

图7 发酵条件对山黑猪肉发酵后色泽的影响Fig.7 Effect of fermentation conditions on color parameters of pork jerky

2.8 发酵条件对山黑猪肉发酵后蛋白质SDS-PAGE的影响

由图8A可知，与1∶1组相比，2∶1和3∶1组a、b、c、d条带变浅，e、f条带加深，可能是随木糖葡萄球菌比例增大，大分子质量蛋白降解并生成小分子质量蛋白。由图8B可知，随接种量增大，所有条带逐渐变淡，表明发酵菌种分泌蛋白酶浓度随接种量增大而上升，蛋白质降解程度增大。由图8C可知，不同发酵温度处理组蛋白分子质量主要集中在66.4～55.0、44.3～29.0 kDa和14.3～6.6 kDa之间。与25 ℃组相比，30 ℃组h处条带变浅，g处条带变深，表明大分子质量蛋白被分解为小分子质量蛋白。35 ℃和40 ℃组所有分子质量的蛋白条带变浅，可能是发酵菌达到适合温度，蛋白酶含量增加，同时pH值迅速降低促进蛋白分解。

图8 发酵条件对山黑猪肉发酵后蛋白质SDS-PAGE的影响Fig.8 Effect of fermentation conditions on SDS-PAGE profile of proteins pork jerky

2.9 发酵条件对山黑猪发酵肉干感官评价的影响

如图9所示，发酵温度30 ℃、接种量107CFU/g和菌种配比2∶1时，感官评价最优。发酵菌种都有最适生长温度，感官评分的差异与发酵菌种在不同发酵温度下生长活性有关。接种量通过影响发酵菌种初始浓度，生长过程中消耗和代谢产物速率不同影响产品感官品质。菌种配比不同导致发酵优势菌不同，木糖葡萄球菌蛋白酶和脂肪酶活性强，分解蛋白和脂肪释放更多风味物质，分泌硝酸盐还原酶和过氧化氢酶起到护色和抗氧化作用[40]。清酒乳杆菌清酒亚种产酸速率快，低酸环境抑制腐败菌和致病菌的生长，导致酸凝胶化或蛋白变性，促进亚硝酸盐分解为NO并与肌红蛋白结合，改善质构和色泽[41]。因此菌种配比不同，感官品质不同。

图9 发酵条件对山黑猪肉干感官评分的影响Fig.9 Effect of fermentation conditions on sensory scores of pork jerky

3 讨论与结论

探究发酵温度、接种量和菌种配比对山黑猪肉干发酵过程中理化指标和感官指标的结果表明，随发酵时间延长，pH值、aw、亚硝酸盐残留量整体降低，FAAs和组胺含量逐渐增大。

发酵工艺主要通过影响发酵菌种的生长活性、菌种浓度以及肉内源酶活性改变发酵特性。不同菌种配比组中，随着木糖葡萄球菌占比增大，FAAs含量、L*、a*逐渐升高（P＜0.05）；随着清酒乳杆菌清酒亚种占比增大，pH值、aw降低，硬度和咀嚼性增大（P＜0.05）。结合多方面因素，菌种配比为1∶1、2∶1、1∶2时，发酵山黑猪肉干品质较优。吴海燕[42]对发酵金丝鱼研究发现，戊糖片球菌和木糖葡萄球菌接种比例为1∶2时，产品品质最佳。夏秀芳等[43]对发酵牛肉串品质特性研究发现，随木糖葡萄球菌占比增大，pH值和a*逐渐增大，硬度减小。

发酵32 h，随接种量增大，组胺含量上升趋势减缓，亚硝酸盐残留量、弹性降低（P＜0.05 ），硬度、咀嚼性、a*逐渐增大（P＜0.05 ），107CFU/g组感官评价最佳，综合评价选取5×106～5×107CFU/g为较优接种量。郭丹等[27]对发酵香肠研究表明，随接种量增大，亚硝酸盐降解率增大，残留量减小。黄俊逸等[44]在香肠加工中发现随接种量增大，硬度、咀嚼性增大，弹性下降。

发酵32 h，随发酵温度升高pH值、aw、亚硝酸残留量呈现先降低后升高的趋势，FAAs、硬度、咀嚼性、L*和a*显示先增大后减小的趋势，结果表明当发酵温度为30～35 ℃时，发酵山黑猪肉干品质较好。陈亚杰[45]和张凤宽[46]等对发酵香肠工艺研究也发现，发酵温度为30 ℃时香肠品质最佳。

综上所述，当发酵时间为24～32 h，发酵温度为30～35 ℃，接种量为5×106～5×107CFU/g，菌种配比为1∶1、1∶2和2∶1时，发酵山黑猪肉干品质较好。