基于生物信息学与分子对接技术对坛紫菜降血压肽的筛选及活性分析

叶贤江，苏志琛，林晓娟，陈继承

（福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002）

全球每年估计有1 750万 人死于心血管疾病，约占全世界死亡人数的31%。高血压是导致心血管疾病的重要原因，其并发症包括但不限于冠心病、中风、充血性心力衰竭、心律失常和肾功能衰竭[1]。血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）可通过破坏肾素血管紧张素系统和激肽系统的平衡而引起高血压[2]。ACE抑制剂药物如卡普托利、赖诺普利、依那普利在临床治疗中具有较强的降压作用，但具有咳嗽、味觉障碍和皮疹等诸多副作用[3]。食源性降血压肽由于其无毒、无副作用、安全性高，且对血压正常者无降压作用，适合长期食用，已成为当前研究的热点[4-5]。

坛紫菜是一类高蛋白、低脂肪、具有丰富多糖和矿物质的多功能营养食品，主要生长在中国、日本和韩国[6]。干紫菜中粗蛋白含量达30%～50%，富含膳食纤维、多种维生素及钙、钾、镁等微量元素，还含藻类特有的藻胆蛋白，具有抗肿瘤、降血糖、抗衰老等功效[7-9]。但目前主要的加工方式为即食海苔、紫菜汤等，经济效益低。坛紫菜高蛋白含量使其成为抗高血压肽的潜在来源，作为合成ACE抑制剂药物的替代品[10-11]。然而，传统的蛋白质水解、分离、反复纯化以获取和鉴定生物活性肽的方法，有耗资较大、周期较长等缺点。为了应对这一挑战，基于生物学查找、筛选活性多肽被引入食源性生物活性肽开发领域。此外，为了深入探索活性肽与ACE相互作用分子机制，将分子对接技术应用于模拟活性肽与ACE分子之间的相互结合过程。

本研究以坛紫菜为原料，采用木瓜蛋白酶和糜蛋白酶双酶联合水解坛紫菜蛋白（Porphyra haitanensisprotein，PHP）制备降血压活性肽，测定了经超滤后各个分子段清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）阳离子自由基能力、铁离子还原抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）以及ACE抑制活性。经质谱鉴定和活性肽数据库BIOPEP以及AHTPDB网站查找筛选活性肽，采用分子对接解释多肽抑制ACE机理，并推导出描述PHP酶解过程规律的动力学关系式。本研究有望为坛紫菜深加工与高效利用以及活性肽的鉴定与制备提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

坛紫菜购于福建福州永辉超市。

马尿酰组氨酰亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）、ACE美国Sigma公司；木瓜蛋白酶（酶活力8.0×105U/g）、糜蛋白酶（1.2×105U/g） 生工生物工程（上海）股份有限公司；DPPH、ABTS及FRAP试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

KH-500DE数控超声波清洗仪 昆山禾创超声仪器有限公司；A11分析研磨机 德国IKA集团；PHB-4 pH计上海仪电科学仪器股份有限公司；Avanti J-26XP台式高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司；LGJ-125冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司；RNM-18G超滤设备 杭州瑞纳膜工程有限公司；2695-2698高效液相色谱 美国Waters公司；Q Exactive Plus组合型四极杆-Orbitrap质谱仪 美国赛默飞世尔科学公司。

1.3 方法

1.3.1 坛紫菜多肽的制备

将坛紫菜在80 ℃烘干，用超微粉碎机粉碎过120 目得到坛紫菜粉，用50 倍体积的水浸提4 h得到蛋白粗提物。经800 W功率超声波作用800 s，5 000 r/min离心15 min得到上清液，量取体积，在磁力搅拌下缓慢加入饱和度为40%磨细的硫酸铵，搅拌过夜，5 000 r/min离心15 min收集沉淀即得较纯的PHP。使用木瓜蛋白酶和糜蛋白酶混合酶（温度45 ℃，底物质量分数5%，木瓜蛋白酶0.6 g/L，糜蛋白酶0.4 g/L，pH 8）在自动摇床上酶解PHP反应12 h，在4 ℃、4 000 r/min条件下离心10 min收集上清液。80%乙醇溶液醇沉除去多糖和未降解的大分子质量蛋白质，上清液旋转蒸发除去乙醇[12]。并使用超滤装置分为＜0.5、0.5～1、＜1、1～3、＜3、3～5、＜5、5～100 kDa 8 个不同分子质量的组分。冻干成粉末，置于－80 ℃冰箱保存。

1.3.2 抗氧化指标的检测

1.3.2.1 DPPH自由基清除能力测定

在96 孔微量培养板中进行测定。每孔加入2 mL的0.015 mmol/L现配DPPH溶液，再加入2 mL的1 mg/mL样品溶液或者2 mL Trolox标准溶液。微板避光室温下放置30 min，并使用酶标仪在517 nm波长处测定吸光度。对照以相同体积的提取溶剂代替样品溶液，空白组以相同体积的甲醇溶液代替DPPH溶液。Trolox标准溶液配制20、40、60、80、100 μmol/L和120 μmol/L。最终结果以每1 g样品冻干粉干质量的Trolox当量抗氧化能力（μmol/g）表示。

1.3.2.2 ABTS阳离子自由基清除能力测定

使用ABTS试剂盒测定，在96 孔微量培养板中进行。每孔加入170 μL ABTS工作液和20 μL试剂4应用液，再加入10 μL 1 mg/mL样品溶液或者10 μL Trolox标准溶液。对照以相同体积缓冲液代替样品溶液，空白组以缓冲液代替ABTS工作液。Trolox标准溶液（10 mmol/L）稀释为100、200、400、800、1 000 μmol/L。最终结果以每1 g样品冻干粉干质量的Trolox当量抗氧化能力（μmol/g）表示。

1.3.2.3 FRAP值测定

测量在96 孔微量培养板中进行。每孔加入180 μL FRAP工作液和20 μL 1 mg/mL样品溶液或20 μL Trolox标准溶液。对照以相同体积缓冲液代替样品溶液，空白组以缓冲液代替FRAP工作液。Trolox标准溶液（10 mmol/L）稀释为100、200、400、800、1 000 μmol/L。最终结果以每1 g样品冻干粉干质量的Trolox当量抗氧化能力（μmol/g）表示。

1.3.3 ACE抑制活性的测定

参考本实验室已建立的方法[13]。反应体系总体积为130 μL。测定管：称取适量冷冻干燥后的样品粉末，将其溶于一定量的0.1 mol/L硼酸缓冲溶液（pH 8.3，含0.3 mol/L NaCl）中，制成1 mg/mL样品溶液。取样品溶液60 μL与ACE溶液20 μL混合，37 ℃水浴10 min后加入HHL溶液50 μL；整个反应体系37 ℃水浴60 min后加入1 mol/L HCl溶液100 μL终止反应；过0.45 μm滤膜，进行液相色谱分析。对照管：用60 μL硼酸缓冲液（pH 8.3，0.3 mol/L NaCl）替代测定组样品溶液。空白对照管：用20 μL硼酸缓冲液（pH 8.3，0.3 mol/L NaCl）替代对照组ACE溶液。色谱柱：Waters-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测波长：228 nm，流动相：80% A（1%甲酸＋1%三氟乙酸＋98%去离子水），20% B（100%乙腈）；流速：0.8 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。ACE抑制率计算如式（1）所示：

式中：[HA]c为对照样品马尿酸浓度；[HA]s为测定样品马尿酸浓度；[HA]H为空白对照中马尿酸浓度。

1.3.4 ACE抑制肽序列鉴定

取适量样本采用C18除盐柱除盐后冻干并复溶于水后，经由配备在线纳喷离子源的液相色谱-串联质谱分析。整套系统为串联EASY-nanoLC 1000的Q Exactive™ Plus质谱仪。共上样5 μL样品（分析柱：Acclaim PepMap C18（75 μm×25 cm）），柱流量控制在300 nL/min，柱温40 ℃，电喷雾电压2 kV，流动相A相为0.1%甲酸溶液；B相为含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱：0～3 min，94% A、6% B；3～42 min，94%～80% A、6%～20% B；42～47 min，80%～65% A、20%～35% B；47～60 min，65%～0% A、35%～100% B。质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在质谱和二级质谱集间切换。质谱参数设置如下：1）质谱扫描范围：m/z100～500；分辨率：70 000；自动增益控制目标：3×106；最大进样时间：50 ms；包括电荷状态：2～6。2）HCD-MS/MS分辨率：17 500；隔离窗口：2.0；自动增益控制目标：1×105；最大进样时间：45 ms；碰撞能量：28。

1.3.5 分子对接

参考张婷[14]的方法，通过分子对接软件AutoDock 4.2进行ACE与活性肽的半柔性分子对接计算。配体和受体分子均加上极性氢和kollman电场，之后忽略所有非极性氢，ACE中的Zn2＋需额外加上0.95 e的正电荷。为了提高活性肽与ACE对接的准确度，以Zn2＋的空间坐标为中心（中心坐标为x：43.821，y：38.240，z：46.712）建立了一个间距0.375 Å、大小100 Å×100 Å×100 Å的反应约束盒子。采用拉马克遗传算法对分子对接能量进行优化。构象能量聚类分析中均方根偏差容忍度为2.0 Å。通过Discovry Studio 4.5对ACE抑制肽与ACE蛋白分子间相互作用进行分析。

1.3.6 活性肽的查找与筛选

降血压活性肽信息来自生物活性肽数据库BIOPEP（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep）和AHTPDB网站（http://crdd.osdd.net/raghava/ahtpdb/pepsearch.php）。

1.3.7 水解动力学公式的推导及模型的建立

参考Wu Qiongying等[15]的方法。在底物PHP质量浓度分别为10、15、20、25 g/L和30 g/L时，用木瓜蛋白酶和糜蛋白酶双酶（木瓜蛋白酶0.6 g/L，糜蛋白酶0.4 g/L）水解PHP。考察酶促反应过程中水解度（degree of hydrolysis，DH）。为研究酶用量对DH的影响，采用混合酶在0.4、0.6、0.8 g/L和1.0 g/L酶解质量浓度为25 g/L的PHP。其他水解条件为：温度50 ℃，pH 8.0，水解时间20～100 min。

推导出的DH与水解时间关系方程式如式（2）所示：

式中：a、b为动力学参数；t为水解时间/min。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 PHP酶解液不同分子质量组分的抗氧化和ACE抑制活性

根据Trolox标准曲线方程Y=－0.000 6X＋0.105 8（R2=0.985 1）计算，不同分子质量PHP酶解液的DPPH自由基清除能力见图1A。可以看出，＜0.5 kDa组分的DPPH自由基清除能力显著高于其他组分（P＜0.05）。Chang Chiyue等[16]发现猪血红蛋白酶解液低分子质量组分相较于高分子质量具有更强的DPPH自由基清除能力。刘冬冬等[17]在使用0.5 kDa的纳滤膜截留条斑紫菜的酶解液后发现DPPH自由基清除能力显著提高。在PHP提取中可能会有多酚类物质残留在PHP酶解液。杨小青等[18]在研究羊栖菜不同分子质量褐藻多酚的抗氧化能力时发现，＞30 kDa的乙酸乙酯提取物具有最强的DPPH自由基清除能力；Wang Tao等[19]在使用酶促法从红藻中提取抗氧化成分时也发现，＜5 kDa的水提物中含有最高总酚含量从而造成其DPPH自由基清除能力最强。这可能是5～100 kDa组分酶解液的DPPH自由基清除能力较高，和＜5 kDa组分差异较小的原因。

图1 不同分子质量PHP酶解液DPPH自由基清除能力（A）、ABTS阳离子自由基清除能力（B）、FRAP值（C）和ACE抑制活性（D）Fig.1 DPPH radical scavenging capacity (A), ABTS cation radical scavenging capacity (B), FRAP value (C) and ACE inhibitory activity (D) of PHP hydrolysate fractions with different molecular masses

Trolox标准曲线方程为Y=－0.000 9X＋1.002 7（R2=0.995 7），不同分子质量PHP酶解液对ABTS阳离子自由基清除能力的影响见图1B。和DPPH自由基一样，＜0.5 kDa组分的ABTS阳离子自由基清除能力最高为544.48 μmol/g，其次是＜1 kDa的组分，二者差异无统计学意义（P＞0.05），但显著高于其他分子质量的组分（P＜0.05）。这一结果与Je等[20]的研究一致，抗氧化肽的ABTS阳离子自由基清除活性随分子质量降低而增强。ABTS阳离子自由基是一种人工合成的亲水性自由基，随着分子质量的降低，抗氧化肽的亲水性不断增强，所以小分子抗氧化肽更易进入反应体系，进而与ABTS阳离子自由基发生反应。

FRAP方法下Trolox标准曲线方程为Y=0.002 5X＋0.172（R2=0.991 4），不同分子质量PHP酶解液的FRAP值见图1C。不同于DPPH自由基和ABTS阳离子自由基，＜1 kDa组分的FRAP值最高，而不是＜0.5 kDa组分。这说明FRAP值可能和分子质量不呈绝对的负相关。Alemán等[21]在研究鱿鱼明胶水解物中多肽的抗氧化活性发现，将10 kDa的组分再细分成4 个组分，并不是分子质量最小的组分Fe3＋还原能力最高。Wiriyaphan等[22]也发现鱼糜副产物的酶解物中1～5 kDa的短肽相较于＜1 kDa、5～30 kDa和＞30 kDa的组分具有最高的抗氧化活性。因此，推断PHP酶解液中抗氧化肽的Fe3＋还原力与其分子质量关系为：分子质量太大或太小，抗氧化肽的还原活性都不高，适中分子质量范围（1～5 kDa）的活性肽的还原能力较高。

PHP分段酶解液对ACE的抑制效果如图1D所示。可以看出，随着酶解液分子质量的不断增大，IC50值也越来越大，即ACE抑制活性越来越低。＜0.5 kDa和0.5～1 kDa酶解液的IC50值显著低于其他分子质量组分（P＜0.05），说明在PHP酶解液中具有较强的ACE抑制活性的多肽集中在1 kDa分子质量以下。曹文红[23]在研究中国毛虾酶解产物的分子质量与ACE抑制活性的关系时发现，抑制活性最强的组分在311～1 320 Da之间。邓真真[24]使用5种酶酶解PHP发现，不管使用哪一种酶酶解，＜1 kDa的组分IC50值均低于1～3 kDa和＞3 kDa。分析其原因是ACE活性中心通常具有一定的空间结构，分子质量较大的多肽不能进入活性中心的狭小空间与ACE活性部位氨基酸有效结合，进而不能干扰ACE与底物血管紧张素I的结合，发挥降血压的活性；而分子质量较小的多肽能够插入活性部位的裂隙中，并与催化相关的氨基酸结合，从而干扰ACE催化底物[25-26]。＜1 kDa组分的IC50值为（2.21±0.28）mg/mL，质谱鉴定选择这一组分。

2.2 ACE抑制肽序列鉴定结果

LDY（Leu-Asp-Tyr）的二级质谱图如图2A所示，其中y1（m/z182.081 1）表明该条肽段的C端氨基酸残基为Tyr，氨基酸残基Aspm/z为y2－y1=115.026 6，而N端残基为Leu（m/zb2－115.026 6=114.091 6）。类似的，二级质谱图4B为AVP（Ala-Val-Pro），图4C为GPL（Gly-Pro-Leu），图4D为LGYL（Leu-Gly-Tyr-Leu），有误差的为部分减水、减氢、减氨基导致。

图2 4 条多肽的二级质谱图和氨基酸序列Fig.2 Secondary mass spectra and amino acid sequences of four peptides

图4 不同底物质量浓度（A）和酶质量浓度（B）PHP的水解曲线以及a值与E0/S0值的线性关系图（C）Fig.4 Hydrolysis curves of PHP with different substrate concentrations (A) and enzyme concentrations (B), and linear relationship between a and E0/S0 (C)

2.3 分子对接与坛紫菜ACE抑制肽的抑制机理解析

活性肽和ACE相互作用关系的探讨有助于对ACE抑制活性机理做进一步解析。使用Autodock 4.2对接软件将质谱鉴定和降血压肽库对比选出的14 条短肽与ACE进行对接。图3为文献报道中具有显著ACE抑制活性的4 条短肽与ACE的对接结果。已有研究表明，氢键相互作用在稳定对接复合体和酶催化反应中起最重要的作用[27]。如图3A所示，LDY与ACE的Asp377、Ala354、Glu384、Asp415和Gln281形成了5 个传统氢键，与Tyr523形成了1 个Pi-供体氢键，其对接能量值为－7.65 kJ/mol。同样的，根据图3B，AVP与ACE的2 个残基Asp415和Gln281形成了3 个传统氢键，与His513和Tyr520形成了2 个碳氢键，其对接能量值为－5.87 kJ/mol。根据图3C，GPL与ACE的Lys511、Gln281、Tyr520和Asp415残基形成了5 个传统氢键，与His353形成了1 个碳氢键，其对接能量值为－6.13 kJ/mol。如图3D所示，LGYL与ACE的Cys352、Glu162、Gln281以及Asn277形成了4 个传统氢键，与Thr282和Glu376形成了3 个碳氢键，其对接能量为－7.78 kJ/mol。

图3 多肽与ACE的对接结果Fig.3 Molecular docking between ACE and peptides

降血压活性肽主要通过氢键相互作用、范德华力以及静电相互作用与ACE结合，进而抑制ACE活性，其中以氢键相互作用尤为重要，可起到稳定对接复合物的作用，且氢键数目直接影响了降血压活性肽对ACE的亲和力，而氢键数目又与活性肽的氨基酸构成紧密联系[28]。LDY、AVP、GPL和LGYL都具有较多氢键和较低对接能量值，C端氨基酸分别为Pro（P）、Leu（L）、Tyr（Y）和Leu（L），这些氨基酸都是疏水或芳香族氨基酸。这与先前的研究结果[11]一致。在纯化鉴定海带中的降血压肽发现，KKFY和SKTY分别与ACE活性口袋的不同残基部位形成了13 个和9 个氢键，具有很强的ACE抑制活性。这些结果一致表明，C端氨基酸的种类及位置对多肽的ACE抑制活性影响至关重要，C末端的疏水或芳香氨基酸残基或Pro（P）对ACE抑制活性的提高有积极作用。

2.4 PHP的双酶水解动力学

由PHP的水解曲线可以看出，DH随着底物质量浓度的增加而降低（图4A），随着酶质量浓度的增加而升高（图4B）。结果表明，酶底比对PHP的DH有很大的影响。从图4可以看出，PHP的DH在40 min迅速升高，然后在40～100 min缓慢升高，这与脱脂小麦胚芽蛋白[29]和刺鳐明胶[30]的水解曲线相似。如表1所示，动力学参数a随底物质量浓度的增加而降低，随酶质量浓度的增加而增加。实验数据表明，动力学参数a不是常数，它随酶和底物质量浓度的变化而变化。然而，酶和底物质量浓度对动力学参数b的影响不遵循一个确定的趋势（增加或减少），接近一个常数，在其平均值0.244附近上下波动。Wu Qiongying等[15]报道了甜高粱籽粒蛋白水解动力学参数b的变化范围很小。因此在一个恒温水解反应中，b可以看作是一个常数，取其平均值。Valencia等[31]也报道了相似的结果，发现三文鱼肌肉蛋白水解动力学参数b的值比a更稳定。通过对a值与E0/S0值作图，发现a与E0/S0呈线性关系如图4C所示。当时，等式y＝63.23x－0.24就可以表示为a＝63.23E0/S0－0.24。将等式代入式（2），则DH和t的关系式就可以表示为：

表1 酶和底物质量浓度对PHP水解a、b值的影响Table 1 Effect of enzyme and substrate concentrations on a and b values of PHP hydrolysis

对于酶解过程，从反应机理出发，推导出描述蛋白可控酶解过程规律的动力学关系式，建立符合实验数据的实验模型，对于加深对影响蛋白质水解过程因素的理解及指导实践有实际意义[32]。为了验证所建立动力学模型的有效性，在不同酶质量浓度和底物质量浓度下进行3 个验证实验，如图5A所示。预测值与实验值的比较表明，所有的相对误差均在10%以下。除水解曲线拟合良好（图5A）外，预测DH值与实验DH值之间的相关关系也表现出良好的线性回归系数，其中当底物质量浓度6 g/L、酶质量浓度0.5 g/L时R2为0.998 72（图5B），当底物质量浓度20 g/L、酶质量浓度1.2 g/L时R2为0.998 56（图5C），当底物质量浓度12 g/L、酶质量浓度0.4 g/L时R2为0.999 38（图5D）。这一验证结果证实了动力学模型的统计意义，表明该模型可靠，可以从操作条件表征和描述PHP的酶解过程。

图5 DH预测值和实验值比较与相关性Fig.5 Comparison and correlation between predicted and experimental values for the degree of hydrolysis

3 结 论

目前，活性多肽的制备路线基本上遵循蛋白质提取→不同酶的水解及条件优化→反复分离纯化→活性测定→结构鉴定这一路线，不仅耗时耗力，而且在反复分离纯化过程中活性肽损失严重。所以，基于生物信息学同实验相结合的方法正成为今后的研究热点。本研究采用基于串联质谱与分子对接技术，通过生物信息筛选和体外活性检测从PHP酶解液中快速鉴定、筛选活性多肽。活性测定实验表明PHP酶解液小于0.5 kDa组分具有最高的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力，小于1 kDa组分具有最高的FRAP值，而分子质量0.5～1 kDa组分具有最高的抑制ACE活性。AVP、GPL、LDY和LGYL 4 条短肽与ACE的分子对接结果表明，多肽主要通过与ACE的活性口袋和氨基酸残基形成氢键进而抑制ACE活性，且多肽C末端氨基酸为疏水、芳香氨基酸或Pro（P）时对ACE抑制活性的提高有积极作用。双酶水解动力学模型预测DH与实验DH的相对误差均在10%以下。本实验为深度开发活性肽的高价值利用和蛋白的可控酶解提供了参考与借鉴。