SFC-Q-TOF-MS法鉴定4种家畜乳甘油三酯及特征分析

刘宇婷，王越男，郭 军,，郭保民，米智慧

（1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；3.内蒙古迪安丰信医疗科技有限责任公司，内蒙古 呼和浩特 010091）

三酰基甘油（triacylglycerols，TAGs）即甘油三酯，是乳中含量最高的脂类，占总脂肪的98%以上，其组成影响乳及乳制品的物理性质和营养价值[1]。对乳脂TAGs组成进行分析是一项非常具有挑战性的工作，乳脂是自然界中脂类成分最复杂的物质[2]，其脂肪酸组成及含量极易受到产乳动物的品种、泌乳期、季节、地域和饲料等多种因素的决定或影响[3]，且甘油骨架上存在多种脂肪酸组合形式，因此会产生大量的TAGs种类[4]，另外TAGs研究缺乏种类齐全的理想标准物质[2]，这些都对TAGs分离和鉴定带来很大难度。近年来超临界流体色谱等新型色谱分离技术和多维质谱等检测鉴定技术的迅速发展，使越来越多研究者开始关注母乳脂肪、血脂及其他油脂TAGs的构成和特征研究[5-7]。

目前TAGs的常用分离方法有高温气相色谱法[8]、反相高效液相色谱法[9]、银离子高效液相色谱法[6]和二维液相色谱法[10]，与质谱仪联用实现TAGs的鉴定和含量测定。这些色谱-质谱联用方法都有准确分析TAGs的潜力，但也存在明显的局限性，如操作繁琐、分辨率差和分析周期长等缺点[11-12]。超临界流体色谱（supercritical fluid chromatography，SFC）兼有液相色谱和气相色谱的优点，具有绿色、低成本、分离速度快和分辨率高等优势，特别适合非极性和低极性化合物的分析。SFC一般采用超临界流体CO2作为流动相，其溶解能力类似于液相色谱的液体流动相，而其黏度和扩散性则与气相色谱载气相似，更有利于传质，不需要过高的温度即可实现分离[13]。CO2作为流动相廉价且无毒，节省了废液处理环节，极大的节省了科研成本，保护环境和实验人员的健康[14-15]。SFC与四极杆飞行时间质谱（quadruple timeof-flight mass spectrometry，Q-TOF-MS）联用则无需标准品，利用质谱提供的准确质量数据和特征碎片离子即可进行分子结构分析，具有灵敏度高、稳定性高和重复性好等优点，但目前在TAGs分析中应用报道还较少[16-17]。

本研究旨在探明我国常见荷斯坦牛、山羊、蒙古马和双峰驼乳的TAGs种类和构成特征，以期为乳品营养成分数据库提供有参考价值的数据，为家畜乳TAGs角度营养评价，以及乳的物种、饲养方式、产地和加工方式真实性判别和鉴定研究做前期工作和提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

原乳样品共采集31 份，其中荷斯坦牛乳6 份（即黑白花牛乳，采自内蒙古巴彦淖尔市圣牧乳业6 个牧场），山羊乳5 份（采自内蒙古鄂尔多斯市乌审旗2 个嘎查），马乳10 份（采自内蒙古锡林郭勒盟、呼伦贝尔市鄂温克旗和鄂尔多斯市乌审旗5 家牧户），双峰驼10 份（采自内蒙古呼伦贝尔草原和阿拉善左旗巴彦浩特2 家牧户）。原乳样品采集后现场液氮冷却，放于－18 ℃以下冰柜中冷冻保藏，测定时在室温环境下解冻和均质后取样检测。

1.2 试剂与仪器

甲醇、乙腈（均为质谱纯），正己烷、甲酸（均为色谱纯） 美国Fisher公司；高纯二氧化碳（纯度≥99.999%） 北京如源如泉科技有限公司。

Xevo®G2-S SFC-Q-TOF-MS联用仪 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 TAGs的提取

准确量取100 μL乳样于10 mL塑料离心管中，再加入2 mL正己烷萃取剂，室温条件下涡旋离心2 min，之后8 000 r/min离心10 min，静置分层，吸取约1 mL上清液，过0.22 μm尼龙滤膜至进样瓶中待测。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Acquity UPC2BEH-2EP（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）；流动相：A相为超临界CO2，B相为甲醇-乙腈-甲酸溶液（50∶50∶0.2，V/V）。梯度洗脱：0～2 min，99.9% A、0.1% B；2～6 min，99.9%～99% A、0.1%～1% B；6～9 min，99%～98% A、1%～2% B；9～15 min，98% A、2% B；15～20 min，98%～93% A、2%～7% B；20～24 min，93%～80% A、7%～20% B；24～24.5 min，80%～99.9% A、20%～0.1% B；流速1.0 mL/min；进样量1 μL；柱温50 ℃；背压1 700 psi。

1.3.3 质谱条件

电喷雾电离源正离子模式，在全信息串联质谱模式下采集m/z50～2 000范围内的物质（分析截取m/z400～1 000）；毛细管电压3.0 kV；锥孔电压25 V；锥孔气流量20 L/h；离子源温度120 ℃；脱溶剂气为氮气，流量800 L/h；碰撞气为氩气；低碰撞能量4 eV，高碰撞能量20～60 eV；数据采集时间共25 min；数据采集软件为Waters UNIFI。

1.3.4 TAGs的鉴定

质谱分析采用全信息串联质谱技术，一次进样可获得高低能质谱图，即一次性获得样品准分子离子和对应碎片离子的精确质量数据。根据低能模式下获得的准分子离子峰[M＋NH4]＋的精确质量数初步推断该分子的相对分子质量，再结合高能模式下获得的碎片离子[M＋H－FA]＋值识别甘油骨架上结合的3 个脂肪酸，同时依据碎片离子的相对丰度推测占据sn-2位的脂肪酸类型，最终鉴定出TAGs的种类。TAGs根据脂肪酸的简称（表1）及其在sn-1、sn-2和sn-3位的排列顺序命名，通常认为与sn-1/sn-3位脂肪酸相比，裂解sn-2位脂肪酸需要更多的能量，因此在sn-2位丢失脂肪酸后产生的碎片离子比丢失sn-1/sn-3位脂肪酸产生的碎片离子丰度低，这有利于推断样品中TAGs分子的sn-2位脂肪酸，由于非手性方法无法区分sn-1和sn-3的对映异构体，故将其视为相同，命名时按脂肪酸分子质量从大到小排列[10,18-21]。

表1 常见脂肪酸的名称、简称、分子式及相对分子质量信息Table 1 Abbreviations, formulas and relative molecular masses of common fatty acids

1.4 数据整理分析

用仪器自带Masslynx V4.1软件采集、形成和分析质谱图。参数设置：质量窗口：20 mDa；保留时间窗口：0.5 min；强度阈值：10 000 counts；5%峰高的峰宽：1.00 s；除燥程度：6.00。

利用乳脂肪基峰离子色谱（base-peak ion chromatogram，BPI）图和每个离子色谱峰的低能和高能质谱图鉴定TAGs分子结构，用BPI图面积归一化法计算每一种TAGs的相对含量。所有乳样鉴定出的TAGs种类和相对含量数据表导入化学计量学软件Pirouette 4.5（美国Infometrix公司）进行主成分分析（principal component analysis，PCA），观察4种家畜乳以TAGs聚类的特征，并观察每一种家畜乳特有的TAGs，快速找到物种共有和特异TAGs，可提升统计比较的效率。

2 结果与分析

2.1 色谱图

牛、山羊、马和骆驼乳全部样品TAGs的BPI见图1。同物种不同样品BPI图形状一致性较高，且有明显的物种特异形态。牛乳的色谱峰呈双驼峰状分布，出峰时间集中在5～12 min，其他3种动物乳TAGs BPI图呈单驼峰状分布。山羊乳的色谱峰数量多且密集，出峰时间集中在4.5～12 min；马乳的色谱峰丰度逐渐升高，出峰时间集中在6～14 min；骆驼乳的色谱峰数量最少，出峰时间集中在8～12 min。BPI图提示牛、山羊、马和骆驼4种家畜乳TAGs分子构成有显著区别，因此营养生理作用也有所不同，提示家畜乳TAGs指纹的物种鉴别潜力很大。QC样品的总离子色谱图保留时间和峰面积重叠情况见图2，重复性较好。

图1 牛（a）、山羊（b）、马（c）和骆驼（d）乳脂肪TAGs基峰离子色谱图Fig.1 Base-peak ion chromatograms of TAGs in cow (a), goat (b),horse (c) and camel (d) milk fat

图2 QC样品的总离子色谱图Fig.2 Total ion chromatograms of quality control samples

2.2 TAGs的鉴定

根据1.3.4节方法对BPI图每个峰的高低能质谱图进行分析，鉴定其分子结构。例如由图3a可知该准分子离子[M＋NH4]＋的m/z766.907 8，由图3b可知，丰度高的碎片离子[M＋H－FA]＋的m/z467.537 8、577.683 7和493.560 2；[M＋NH4]＋的质量减去1 个NH4＋的相对分子质量（18），加上1 个H＋的质量，再减去1 个碎片离子的质量即可得到丢失脂肪酸的质量，从而推算出该TAGs分子由油酸（O）、癸酸（C）和棕榈酸（P）组成，对应的碎片离子为[P－C]＋、[O－P]＋和[O－C]＋。[O－C]＋丰度最低所以棕榈酸占据sn-2位，油酸质量数大于癸酸，故推测该TAGs分子为O-P-C，分子式为C47H88O6。由于乳中的TAGs成分十分复杂，会有一些共流出物质和同分异构体，导致碎片离子数不止3 个，这给确定TAGs分子构成带来复杂性和难度。对共流出物质的识别是通过将准分子离子与碎片离子一一对应，将不符合脂肪酸相对分子质量的碎片离子剔除。推算出该分子的脂肪酸构成后会进行反推验证，甘油的相对分子质量（92）加上推测出的3 个脂肪酸的质量，减去酯化反应脱去3 个H2O分子的质量，再加上1 个NH4＋的质量后需与准分子离子[M＋NH4]＋的质量数一致才能认定为TAGs分子。BPI图中的1 个峰，也可能有几种分子质量一样的TAGs，例如图4a马乳样品中6.95 min流出的物质其准分子离子峰m/z为656.743 7，在图4b高碰撞能量下准分子离子碎裂形成几个碎片离子，包括m/z439.488 1、467.524 5、411.446 6、383.407 5、495.557 5，对应的5 个脂肪酸的相对分子质量为200、172、228、256和144，即月桂酸（La）、癸酸（C）、肉豆蔻酸（M）、棕榈酸（P）和辛酸（Cy），它们能构成La-La-La、P-Cy-La、La-M-C、M-M-Cy和P-C-C 5种TAGs分子。该实验还分离识别出一部分不同出峰时间的同分异构体对，比如图5a低能质谱图在牛乳样品中7.57 min流出的物质其准分子离子峰m/z为684.819 3，在图5b高能质谱图中碎片离子m/z为411.471 5和551.666 9，而在图5c 7.68 min流出的物质其准分子离子峰m/z684.819 3，在图5d高能质谱图中碎片离子m/z383.427 6、411.471 5和579.706 4，经计算这两个色谱峰为同分异构体P-P-Co和S-Bu-P分子。

图3 O-P-C TAGs的低能质谱图（a）和高能质谱图（b）Fig.3 Mass spectra of TAGs O-P-C under low collision energy (a) and high collision energy (b)

图4 La-La-La、P-Cy-La、La-M-C、M-M-Cy和P-C-C 5种TAGs低能质谱图（a）和高能质谱图（b）Fig.4 Mass spectra of TAGs La-La-La, P-Cy-La, La-M-C, M-M-Cy and P-C-C under low collision energy (a) and high collision energy (b)

图5 同分异构体P-P-Co和S-Bu-P的质谱图Fig.5 Mass spectra of isomers of P-P-Co and S-Bu-P

2.3 4种家畜乳TAGs鉴定结果

4种家畜乳鉴定出的TAGs种类和参数汇总结果见表2，具体种类和相对含量（各物种样品的平均值）结果见表3。共鉴定出145种TAGs，牛、山羊、马和骆驼乳分别鉴定出60、66、74种和44种TAGs。

表2 4种家畜乳TAGs的汇总结果Table 2 Summary of TAGs in four milks

表3 4种家畜乳TAGs的种类及相对含量Table 3 Types and relative contents of TAGs in four milks

续表3

续表3

4种家畜乳TAGs相对分子质量在470～888之间，酰基碳总链数为24～54；驼乳TAGs相对分子质量整体较大，在638～888之间，酰基碳总链数也最长，在36～54之间，说明主要有长链脂肪酸构成；而山羊乳小分子质量TAGs较多，最低为470，酰基碳总链数为24～54，提示有较多中短链脂肪酸参与其分子构成。

有14种碳数4～20，双键数0～3的脂肪酸参与了4种家畜乳TAGs的构成。本实验在牛乳和山羊乳中检测到的TAGs由12种脂肪酸组成，分别是丁酸（Bu）、己酸（Co）、辛酸（Cy）、癸酸（C）、月桂酸（La）、肉豆蔻酸（M）、十五烷酸（Pe）、棕榈酸（P）、棕榈油酸（Po）、硬脂酸（S）、油酸（O）和亚油酸（L），除以上12种脂肪酸外，仅在马乳和骆驼乳中检测到由必需脂肪酸亚麻酸（Ln）组成的TAGs，并仅在马乳中检测到由二十烯酸（E）组成的TAGs，但未检测到十五烷酸（Pe）。山羊乳和牛乳的TAGs最多含4 个双键，骆驼乳最多含5 个双键，马乳最多可含9 个双键。

2.3.1 4种家畜乳TAGs饱和度的比较

根据4种家畜乳TAGs分子的双键数可分成10 组，见图6。牛乳、山羊乳、马乳和骆驼乳中多不饱和TAGs相对含量依次为14.12%、8.93%、67.08%和21.5%，单不饱和TAGs相对含量依次为37.55%、34.89%、15.13%和39.6%，饱和TAGs相对含量依次为48.34%、56.18%、17.79%和38.9%。

图6 不同双键数TAGs在4种家畜乳中相对含量的比较Fig.6 Comparison of relative contents of TAGs with different double bonds in four milks

2.3.2 4种家畜乳中主要的TAGs

4种家畜乳相对含量大于4%的TAGs汇总见表4。在本实验鉴定出的TAGs分子中发现骆驼乳中的每种TAGs分子至少包含肉豆蔻酸（M）、棕榈酸（P）、硬脂酸（S）和油酸（O）中的一种，而含量高（≥4%）的几种TAGs全部由M、P、S和O组成；马乳中含量高的TAGs都由Ln参与构成；山羊乳中含量高的TAGs都由饱和脂肪酸组成。

表4 4种家畜乳主要的TAGs及其相对含量Table 4 Major TAGs and relative contents in four milks

2.4 PCA

4种家畜乳样品TAGs的PCA结果见图7。4种家畜乳在二维空间以物种聚类，距离远近符合物种分类远近（图7a）。同属牛科的牛和山羊乳样品聚类共同分布于PC2轴上方，且聚类簇距离最近；马乳和骆驼乳分别聚类在另两个区域且相距较远。由图7b可知，牛乳的特征TAGs分子为O-Bu-P、P-M-Bu、P-P-Co和P-M-Co；山羊乳的特征TAGs分子为P-P-Bu、P-Co-C、P-Cy-M/P-C-La/M-La-La和O-C-Bu；马乳的特征TAGs分子为O-C-L、Ln-P-Cy、Ln-P-C、O-P-Ln和Ln-P-Ln；骆驼乳的特征TAGs分子为P-P-M、O-M-P、O-P-P、M-P-S/P-P-P和S-P-P，与表3直接分析统计结果一致，即对TAGs鉴定结果的PCA，有助于快速找到每个物种的特征TAGs，从而提高对比分析效率。PCA结果也能看出，每个物种聚类簇样品散点比较集中，说明每个物种乳样虽然来自不同地区或牧场、不同个体，但TAGs种类和构成一致性较高。

图7 4种家畜乳TAGs特征PCA图Fig.7 PCA score and root plots of TAGs in four milks

3 讨 论

本研究马乳中不饱和TAGs相对含量高达82.2%，其中必需脂肪酸Ln和L参与构成的TAGs相对含量分别为45.43%和21.05%，国内外鲜见马乳TAGs的系统研究报道，但马乳和肉脂肪酸特征研究较多。马奶原乳和干粉样品中不饱和脂肪酸（C18:2和C18:3）含量（19%～25%）都比牛乳（2%～4%）高，尤其α-亚麻酸可以作为马乳的标志性特征[22-23]。人乳脂中也含有较高含量的不饱和脂肪酸（＞50%）[24]，马乳不饱和脂肪酸比例比牛乳更接近人乳[25]。不饱和脂肪酸对胆固醇代谢有很好效果，可以通过抑制血液中胆固醇沉积和溶解胆固醇结石降低组织和血液胆固醇含量[23]。在一些国家经常用马乳替代牛乳，为牛乳过敏儿童提供营养[26]。本研究骆驼乳脂肪中所有TAGs分子至少包含肉豆蔻酸（M）、棕榈酸（P）、硬脂酸（S）和油酸（O）中的一种，而含量高（≥4%）的几种TAGs全部由M、P、S和O组成，这与Haddad等[27]研究基本一致，其报道骆驼乳99%的TAGs分子至少由M、P、S和O 4种主要脂肪酸中的一种组成。Haddad[27]和Ali[28]等先前还报道C14:0-C16:0-C18:0（M-P-S）和酰基链总碳数与双键数为48∶1的TAGs在骆驼乳中最丰富，本研究驼乳M-P-S和O-M-P两种TAGs含量高达9.59%和8.44%。高希西[18]报道人乳中含量最高的10种TAGs分别是O-P-O、O-P-L、P-O-P、L-P-O、S-P-O、P-L-P、O-O-O、L-P-L、O-L-O和O-M-O，约占人乳TAGs总量的60%[9,18]，其中含量最高的为O-P-O占14.83%。目前提倡婴幼儿配方乳粉强化O-P-O以使产品的油脂更接近母乳[29]，本研究发现骆驼乳脂肪中O-P-O含量最高，为5.04%，而山羊乳脂肪含量仅为1.8%；而母乳中最丰富的10种TAGs在骆驼乳中同样最丰富，高达26.07%；郭军等[30]综述驼乳脂肪酸的组成与其他反刍动物存在较大差异，而与人乳有很大的相似性，可见驼乳脂肪TAGs更适合在婴幼儿乳粉中添加。Ali等[28]研究发现山羊奶中己酸（Co）、辛酸（Cy）和癸酸（C）含量较高，由它们参与构成的TAGs也是山羊乳脂中含量最高的组分。本研究中山羊乳含量最高的几种TAGs均有这3种脂肪酸参与构成，与长链脂肪酸相比，中短链脂肪酸会优先被肠道吸收[31]。马乳和骆驼乳营养价值很高，倍受消费者青睐，需求量远大于产量，因而价格也远高于牛乳和山羊乳。如何提高产奶量并保障产品品质和真实性是当前值得关注和研究的问题。

本研究发现家畜乳TAGs组成有显著的物种分类学特征，本研究对4种家畜乳，尤其蒙古马和双峰驼等乳脂肪中的TAGs构成进行了较系统的测定和分析，评价了4种常见家畜乳脂肪TAGs的特征，也丰富了家畜乳营养成分数据库。同时本研究结果提示TAGs指纹有望用于特种家畜乳真实性鉴别。

本研究在利用质谱图分析鉴定TAGs、4 个物种TAGs比较中结合或引入了聚类分析和分类分析，PCA和软独立模式分类效果很好，可直观观察物种以TAGs或质谱数据在二维空间聚类特征，并根据根向量图及聚类贡献率分析表，可直观快速确定物种差异TAGs，大大提高了TAGs质谱数据分析通量和鉴定的速度。乳脂肪TAGs及其质谱指纹数据值得深入挖掘和研究，其独特性有望用于特种家畜乳真实性判别和产品追溯。刘莉敏等[32]报道质谱指纹可用于蜂胶真实性的判别，刘梦静等[33]报道绵羊肉的脂肪酸指纹与放牧舍饲相关，TAGs指纹应该也能做到，因为TAGs与乳脂肪酸类似，易随物种、饲养方法、地理环境及气候条件、年龄和胎次不同而变化，而且TAGs有3 个脂肪酸组合构成，因此TAGs组潜藏着丰富的信息，有待研究和解码。

4 结 论

本研究采用SFC-Q-TOF-MS法结合PCA对荷斯坦牛、山羊、蒙古马和双峰驼乳4种家畜乳的TAGs组成进行鉴定和分析，共鉴定出145种TAGs，其中牛、山羊、马和骆驼乳分别鉴定出60、66、74种和44种TAGs。4种家畜乳的基峰色谱图差异明显。对TAGs进行PCA 4种家畜乳样品以物种聚类明显分离，距离远近符合物种分类远近。本研究为更全面地认识我国荷斯坦牛、山羊、蒙古马和双峰驼乳的TAGs组成特征提供参考，丰富乳营养成分数据，为家畜乳TAGs角度营养评价提供参考，本研究也提示TAGs可用于建模判别家畜乳物种真实性，或可建立模型判别饲养模式和环境。