基于双极电化学法的细胞负载型水凝胶可控制备

李长悦，解 飞，马 立

（上海大学 机电工程与自动化学院，上海 200444）

近年来，水凝胶在生物工程领域中得到了快速发展，其应用越来越广。例如，水凝胶支架可用于药物运输，传递生物活性分子或包囊分泌性细胞[1]；利用微流道芯片制造结构复杂的水凝胶纤维等[2]。其中，海藻酸钙水凝胶的应用最为广泛，它具有无毒、良好的生物相容性、优良的生物降解性、制备方法简单和低廉的价格等优点[3]。组织工程中控制水凝胶的形状至关重要，因为细胞间的相互作用在形状一定的水凝胶微环境中才得以实现[4]。目前，制备海藻酸钙水凝胶的常用方法有乳化法、微模塑法、微流控纺丝法等，但这些方法都无法控制Ca2+的释放数量和释放位置，更不能准确控制水凝胶的形状、大小，因此常采用电沉积法制备不同形状结构的水凝胶[5～7]。电沉积法可以通过调节电压大小、电极形状、电沉积时间等因素来控制Ca2+的释放[8]。

与传统的在驱动电极上生成水凝胶的单电极电沉积法不同，双极电化学法制备海藻酸钙水凝胶原理是：当1个导体置于2个驱动电极之间且场强足够大时发生极化，在导体两端会产生电化学反应。双极电化学法在传感器、微纳米机器人、材料科学等领域已逐步得到应用[9～11]，例如，基于金属双电极的传感装置的制备[12]、利用电击法控制化学反应和产物的生成[13]等。在生物工程领域，应用双极电化学法进行体外支架构建的研究才开始起步，这种方法具有灵活性高、成本低、可控性强等优点，有深入研究的必要。

本文提出了一种基于双极电化学法制备海藻酸钙水凝胶的方法，使用光刻技术制造出圆形、椭圆形、齿轮形和六边形的双极电极(Bipolar electrode，BPE)，通过控制驱动电极的电压、间距进而控制Ca2+的释放速率，达到定量、准确制备水凝胶的效果。此外，本文还建立了基于双极电化学法的海藻酸钙水凝胶高度生长模型，分析了影响海藻酸钙水凝胶生成高度的关键因素。最后，在制备出的图案化海藻酸钙水凝胶支架中培养Hepa 1-6 小鼠肝癌细胞，验证该方法的可行性。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

海藻酸钠：黏度1.05～1.15 Pa·s，天津市福晨化学试剂厂；碳酸钙(CaCO3)、无水氯化钙(CaCl2)、氢氧化钠、医用消毒酒精、无水乙醇、丙酮：上海国药集团化学试剂有限公司；光刻胶：AZ5214，苏州研材微纳科技有限公司；磷酸缓冲液(PBS)、完全培养基:上海中乔新舟生物科技有限公司；活细胞/死细胞双染色试剂盒：上海翊圣生物科技有限公司。

灭菌培养瓶：上海柏根生物科技有限公司；直流电源：LP305DE，深圳市乐达精密工具有限公司；匀胶机(手动型)：KW-4A，北京市赛德凯斯电子有限公司；生物光学显微镜(带荧光组件)：OLYMPUSCKX53，广州市明美光电技术有限公司；铂(Pt)片电极：北京市中华仪器有限公司；ITO 导电玻璃：洛阳市古洛玻璃有限公司；定制掩模板：长沙韶光铬版有限公司。

1.2 实验器材消毒处理

为了防止细菌与灰尘等污染实验器材、影响细胞培养实验，称取氢氧化钠20 g，用定量移液管吸取无水乙醇75 mL和丙酮5 mL，加入培养瓶配置100 mL清洗液。使用一次性棉片蘸取清洗液擦拭磁力搅拌器、铂片、直流电源表面，再用75%的医用消毒酒精擦拭，清除表面残留的清洗液。最后，用酒精棉片擦干实验器材，置于超净台上紫外线照射10 min，保证其无菌状态。

1.3 实验溶液配置

首先配置电沉积溶液。称取0.50 g 的海藻酸钠粉末和0.25 g 的CaCO3粉末，倒入无菌培养瓶并用玻璃棒搅拌。将装有粉末试剂的无菌培养瓶置于磁力搅拌器中，设置搅拌温度为37 ℃、搅拌速度为400 r/min、搅拌时间为24 h。最后，取10 g 氢氧化钠粉末加入搅拌后的溶液中并用玻璃棒再次搅拌，调至溶液

pH=7.3。

然后配置氯化钙溶液。取培养瓶装取100 mL超纯水。用电子分析天平称取1.1 g 无水氯化钙颗粒，加入培养瓶中并用玻璃棒充分搅拌，得到浓度1.1%的CaCl2溶液。将配好的CaCl2溶液与电沉积溶液放在超净台上紫外线照射10 min，保证其无菌状态。

1.4 图案化BPE制备流程

由于用双极电化学法制备水凝胶时，水凝胶会在BPE 上沉积。因此，可以通过控制BPE 上的图案来控制海藻酸钙水凝胶的沉积形状。本文利用氧化铟锡(Indium tin oxide,ITO)导电玻璃进行光刻制作图案化BPE，其具体制作流程如Fig.1所示。

Fig.1 Flow chart fabrication of microelectrode by photolithography

Fig.2 Patterned electrodes on ITO glass

首先，将绝缘的光刻胶滴加在ITO导电玻璃上，用匀胶机均匀涂抹；然后，盖上印有图案的掩模板，用紫外灯照射10 s 左右，未被掩模板盖住的光刻胶可溶性改变，放入110 ℃的烤箱中固化5 min；最后，将覆有光刻胶的ITO 玻璃置于显影液中，被紫外灯照射的光刻胶与显影液发生反应被溶解，即可在ITO 玻璃上留下特定形状的BPE。本实验定制了不同大小的圆形、六边形、齿轮等形状的掩膜板，用光刻法做出如Fig.2所示的BPE。

1.5 双极电化学法原理

当直流电源接通后，浸入溶液中的导电物体会产生电势差，在该导体上同时发生氧化反应和还原反应，于是称这种导体为BPE[14，15]。本文采用双极电化学法制备形状可控的水凝胶实验系统包括铂片电极、电沉积溶液和BPE。Fig.3 所示是一种典型的双极电化学法的原理图。将BPE 放在电解液中，在驱动电极之间施加电压，其化学反应如Fig.3所示。

首先，随着施加直流电压，在BPE靠近阴极端的溶液中的水发生电解，生成氢离子：

然后，氢离子与碳酸钙反应生成钙离子并释放二氧化碳：

Fig.3 Schematic diagram of the bipolar electrochemical method

最后，释放的钙离子与溶液中的海藻酸根离子发生离子交联反应生成海藻酸钙水凝胶：根据式（1）～（3）可知，水凝胶的沉积量会随着发生电化学反应时间的变化而变化。

1.6 细胞活性检测准备

将存活率相对较高、价格便宜的Hepa 1-6小鼠肝癌细胞(上海中乔新舟生物科技有限公司)接种到25 cm2无菌培养瓶中，并置于37 ℃，5%CO2培养箱中，当培养至密度约为90%时可用。在培养瓶中加入胰酶，用灭菌胶头滴管轻轻吹打使细胞分散，得到密度为(4.0～6.0) × 106mL-1混合均匀的细胞悬液。最后，将适量的电沉积溶液(海藻酸钠1%g/mL；Ca-CO30.5%g/mL)加入细胞悬液中，得到的细胞密度约为(1.0～2.0)×104mL-1。

1.7 水凝胶高度生长模型建立

Fig.4为本实验用于进行基于双极电化学法的海藻酸钙水凝胶沉积的装置图，实验装置包括直流电源、2 个10 mm×20 mm 的铂片驱动电极、20 mm×20 mm×2 mm 的ITO 玻璃制作的BPE 和装有电沉积溶液的培养皿。

为建立基于双极电化学法的海藻酸钙水凝胶高度生长模型，对溶液中的电势差进行分析，如Fig.5所示，ΔEelec代表了形成水凝胶所需的BPE 两端电位差，由式(4)求得

式中：Etot—驱动电极的外加电压值(直流电源电压)；lbipo—BPE 长度；ltot—驱动电极间距。将整个双极电化学反应的系统等效为如Fig.6 所示的闭合电路，R4与R0的值满足式(5)

Fig.4 Diagram of the experimental device

Fig.5 Solution potential of the system

其中，2个驱动电极与电沉积溶液间的界面可以分别等效为RC电路，R1和R2分别为ITO 玻璃与两驱动电极间溶液的内阻，R3为电解质溶液(在BPE 范围)的内阻，R0是总电路中的其他电阻之和(包括电源内阻，电极与电解液间的电阻)。E0为电解液的反电动势,R4两端电压等效为BPE 分到的电压，I为回路中的总电流，I1和I2等效为ITO玻璃与两驱动电极间的电流。通过计算可得：

Fig.6 Equivalentelectriccircuitofthebipolar electrochemistrysystem

式中：U0—阳极-溶液和阴极-溶液的界面电容引起的压降，与E0相比可以忽略不计；U1，U2—C1与C2两端的电压。

在BPE 长度lbipo=20 mm、驱动电极间距ltot=30 mm的实验条件下，每隔20 s分别测量12 V，12.5 V，13 V电压下闭合电路中的电流值，如Fig.7中的散点所示。从实验结果可以看出，随着电压增强，电流也逐渐增强；且在最开始通电时电流强度最大，随着时间延长，电流逐渐减小并趋于平稳。这是因为，随着电化学反应的进行，阳极极板上沉积了一层致密的水凝胶且溶液中Ca2+浓度降低，反应速率下降，与式(10)中推导出的闭合回路中电流的表达式相符。

根据t=0s 时测量得到的电流值It1=6.60μA(Etot1=12 V)，It2=7.03μA(Etot2=12.5 V)，首先可以计算出通电瞬间电解液的反电动势(E0)。将通电瞬间的等效电路视为短路，E0可通过式(7)计算

得E0=2.919 V。

求解式(6)可以推导出等效电路闭合回路中总电流(I)的表达式

在直流电源电压分别为12 V，12.5 V时，经过拟合得到的电流值与时间的关系

由式(9)和式(10)可分别求得2 组R(R1,R2)和2组C(C1,C2)的值，取平均值作为最终的结果，具体参数如Tab.1所示。

Tab.1 Parameters achieved by curve fitting and the decided value for parameters in built circuit model

将求出的参数代入式(8)可以得到在两极间电压强度不同时，闭合回路中的电流随时间变化的关系式

绘制出电压分别为12 V，12.5 V和13 V时，根据式（11）计算所得的电流随时间变化的曲线，如Fig.7

中虚线所示；绘制出12 V，12.5 V和13 V下测量值的散点图与拟合曲线作对比。求得3种电压下测量值的拟合曲线与计算所得曲线之间的绝对平均误差分别为ε12.0=0.533,ε12.5=0.790,ε13.0=0.741，由此可以看出，预测电流与测量电流之间的整体匹配度较高，但由于等效电路中没有考虑包括电感在内的其他影响因素，某些时间段内的预测值有一定偏差。

Fig.7 Measurements and the calculated curves at different voltages

由于水凝胶的沉积量与生成的H+数成正比，而H+的生成数又与电荷量成正比，故水凝胶的沉积量与电荷量也成正比

式中：ρ—海藻酸钙水凝胶的密度；S—发生反应的双电极区域面积；h—生成水凝胶的高度；k—常数；Q—电荷量。水凝胶的生长高度表达式为

式(11)可看作将回路中的电流值等效成2 个电容器充电电流之和，即法拉第电流和非法拉第电流，然而，其中只有法拉第电流用于海藻酸钙水凝胶的沉积。电容器C2的充电电流不会通过电解液，因此，电容器C1的充电电流决定了水凝胶的形成。故水凝胶的高度可表示为

式中：a—比例系数；a=k/Sρ由水凝胶的沉积区域面积和水凝胶密度决定。

分析最终建立的水凝胶高度模型可以看出，水凝胶的高度与直流电源电压、驱动电极间距与BPE的长度比值、电化学反应时间这几种参数密切相关。为了确定比例系数a的值，在2 个电压(12 V,12.5 V)时，分别利用MATLAB软件计算a的值(a12V=204.7，a12.5V=220.3)，取平均值a=212.5 作为最终结果，所以水凝胶的高度表达式为

2 结果与讨论

2.1 双极电化学法制备水凝胶

在直流电源电压12.5 V，BPE 的长度与极板间距比值（）为2/3(极板间距为30 mm)，电化学反应时间为50 s 时，基于双极电化学法制备出的海藻酸钙水凝胶如Fig.8(a)和Fig.8(b)所示，仅沉积在图案化的BPE区域，且所制备的图案化水凝胶高度平整，密度较为均匀，由于反应生成了CO2气体，水凝胶中包含了气泡。实验结果表明，双极电化学法制备海藻酸钙水凝胶可以有效地控制水凝胶的沉积形状，通过使用不同图案的BPE就能够制备出特定形状与尺寸的海藻酸钙水凝胶。此外，使用定制的阵列化图案的掩模板制备出如Fig.8(c)所示的图案化水凝胶阵列，正方形为ITO 玻璃，它的表面是一层光刻胶，只在图案处沉积了薄薄的水凝胶。Fig.8(d)清楚地显示出通过双极电化学法制备的水凝胶高度，为探究测得的高度参数与影响高度的实验参数之间的关系做准备。

Fig.8 Calcium alginate hydrogel with different shapes

2.2 实验参数对水凝胶高度的影响

根据双极电化学法制备水凝胶的生长模型可知，水凝胶的生长高度与直流电源的电压(Etot)、反应时间(t)、BPE 长度与极板间距之比()的大小有关：当Etot与一定时，e-t与h成反比；当Etot与t一定时，与h成正比；当与t一定时，Etot与h成正比。为验证水凝胶的高度生长模型的可靠性并探究各参数对高度生长的影响，利用控制变量原则，针对不同直流电源电压、不同电化学反应时间以及不同条件对水凝胶沉积的影响展开实验。图中的“工”形为误差棒，上下限分别为5 次实验中的最大和最小值，圆点为相同实验条件下5次测量数据的平均值。

2.2.1 直流电源电压：为了研究不同直流电源电压对水凝胶高度的影响，（考虑到水凝胶需要包埋Hepa 1-6小鼠肝癌细胞），电压不宜过大。在BPE的长度与极板间距比值为2/3、电化学反应时间为50 s、在直流电源电压分别为12 V，12.5 V，13 V，13.5 V时，制备了图案化海藻酸钙水凝胶，并观察水凝胶的沉积效果。其中一组如Fig.9(a)所示，其厚度根据像素比例计算得出。如Fig.9(b)所示，实验值与根据高度模型绘制的直线误差在5%以内。由此可以看出，在一定电压范围内，水凝胶高度随着直流电源电压的增加而增加。这是由于电压越大，BPE 上的电压也越大，BPE 与驱动电极阳极之间的电势差也随之增加。这就导致电解水反应更加剧烈，产生了更多的H+，从而使电解液中未溶解的CaCO3纳米颗粒释放出的Ca2+总量增加。释放的Ca2+与海藻酸根离子发生离子交联反应，致使水凝胶高度增加，这与生长模型的规律也是符合的。

Fig.9 (a)Height chart of hydrogel at different voltages;(b)comparison of measured and predicted values

Fig.10 (a)Height chart of hydrogel at different time;(b)comparison of measured and predicted values

2.2.2 电化学反应时间：为研究不同电化学反应时间与水凝胶高度的关系，在BPE 的长度与极板间距比值()为2/3、直流电源电压为13 V时，分别测量时间为20 s，40 s，60 s，80 s，100 s，200 s 在BPE 图案上海藻酸钙水凝胶的沉积高度，其中一组的实验效果如Fig.10(a)所示。如Fig.10(b)所示，实验值与根据高度模型计算得到曲线之间的误差在5%以内。由此看出，在一定时间范围内水凝胶的沉积高度随着时间的延长而增加。这是因为电化学反应时间越长，溶液中电解产生的H+数量更多，从而促使水凝胶沉积量增加。不过随着时间延长，水凝胶会由体积增加为主转向密度增加为主，所以随着时间延长，水凝胶高度的增长速率逐渐降低。

Fig.11 (a)Height chart of hydrogel at different ratios of BPE length to Pt plate spacing;(b)comparison of measured and predicted values

2.3 细胞活性实验

为检测海藻酸钙水凝胶支架中细胞的存活率，本文采用Calcein-AM/PI 活细胞/死细胞双染色试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)给细胞染色，染色试剂溶液中的钙黄绿素(AM)和碘化丙啶(PI)的浓度分别为2μmol/L 和4.5μmol/L。将包埋细胞的海藻酸钙水凝胶均分为6组，置于温度为37 ℃、CO2浓度为5%的培养箱中，分别培养0 h，4 h，8 h，12 h，16 h和20 h。将荧光显微镜波长设置为490 nm观察染色细胞的荧光图像Fig.12(a)，其中红色荧光细胞为死细胞，绿色荧光细胞为活细胞。对各个时间荧光图像通过ImageJ 软件计算活细胞的数量，即计算荧光图像中绿色通道中的像素数获得活细胞数量，进而求得细胞存活率，如Fig.12(b)所示，前8 h 随着时间增长，海藻酸钙水凝胶支架中的细胞存活率下降缓慢，8 h 后细胞存活率逐渐趋于稳定，在20 h 时测得细胞存活率大于80%。

Fig.12 (a)Cell-encapsulated alginate gel staining results using calcein-AM and propidium iodide at 0 h,4 h,8 h,12 h,16 h,and 20 h;(b)average cell viability in the patterned hydrogel

3 结论

本文提出了一种制备特定形状和尺寸的海藻酸钙水凝胶微支架的新方法。通过光刻法制备图案化BPE，利用双极电化学法在BPE上沉积圆形、齿轮形的水凝胶。然后，通过建立等效电路推导出海藻酸钙水凝胶的生长模型，分析影响成胶高度的主要参数，得到高度模型与实际测量值之间的误差在5%以内。然后在直流电源电压为12.5 V，驱动电极间距为30 mm，电化学反应时间为50 s时，制备出圆形和齿轮形的水凝胶支架及水凝胶阵列。最后，成功将Hepa1-6 小鼠肝癌细胞包埋在基于双极电化学法制备的海藻酸钙水凝胶支架中，检测20 h后Hepa1-6小鼠肝癌细胞的存活率大于80%。

使用该方法制备海藻酸钙水凝胶支架具有成本低、可控性强、细胞存活率较高的优点，在体外构建人工组织器官方向显示出了广阔的应用前景，为生物医学与组织工程学领域提供了新的研究思路。