BC98-Ⅰ和B96-Ⅱ发酵液对马铃薯的防病促生作用及对土壤酶活性的影响

郝变青, 马利平, 赵永胜, 石文鑫, 王建雄, 景玉川

（1.山西农业大学山西功能农产品检验检测中心, 太原 030031；2.山西农业大学玉米研究所, 山西忻州 034000）

马铃薯营养丰富, 具有低脂肪、高碳水化合物、高维生素、高钾等特点, 有“地下苹果”“第二面包”之美誉, 市场前景十分广阔[1]。全世界大约有150多个国家种植马铃薯, 欧洲和亚洲是马铃薯生产和种植的主要区域, 种植面积在106hm2以上的国家有中国、俄罗斯、印度和乌克兰, 占世界总种植面积的58%以上；总产量在2×107t以上的国家有中国、印度、俄罗斯、乌克兰和美国, 占世界总产量的60%以上[2]。据国家统计局数据, 2012—2019年, 我国马铃薯种植面积稳定在5.6×106hm2左右, 鲜薯年产量达9.5×107t[3]。

近年来, 随着我国马铃薯主粮化的推进, 马铃薯的种植面积逐渐扩大。然而, 随着雨水的增多, 马铃薯病害发生也日趋严重。晚疫病是影响马铃薯产量最大的病害, 在马铃薯生育期发生晚疫病后, 植株地上部分受到真菌侵染, 叶片受损或坏死, 影响光合作用, 导致块茎无法膨大生长, 造成产量损失严重[4-5]。目前, 生产上防治马铃薯晚疫病主要是采用代森锰锌、甲霜灵·锰锌波尔多液、多菌灵、杜邦克露、嘧菌酯、百菌清、福美双、水合霉素等化学药剂[6-7], 且化学农药的喷施次数和喷施量呈逐年增长趋势。过量施用化学农药不仅增加生产成本, 还严重威胁农产品质量安全和生态环境安全, 由此引发的环境污染和农产品质量安全等重大问题日益突出。目前, 在马铃薯晚疫病的防治上, 采用生物防治的研究较少[8]。生物防治具有低毒、绿色环保等优点, 已成为目前的研究热点。为了大力推进马铃薯病害绿色防控工作, 减少化学农药施用量, 实现“双减”目标, 本研究利用自主研发的蜡状芽孢杆菌BC98-Ⅰ（Bacillus cereus）和枯草芽孢杆菌B96-Ⅱ（Bacillus subtilis）发酵液对马铃薯晚疫病进行生物防治研究。前期试验表明, BC98-Ⅰ和B96-Ⅱ发酵液对多种蔬菜土传病害具有明显的防治效果, 且对植株有显著的促生作用[9]。因此, 为探究广谱促生B96-Ⅱ和BC98-Ⅰ发酵液对马铃薯晚疫病的防治效果, 开展室内及田间试验, 研究其对马铃薯生物量的促生作用及其对晚疫病的防治效果, 同时测定发酵液对土壤酶活性的影响, 探索适宜马铃薯晚疫病绿色防控的新型药剂, 以期为山西地区马铃薯晚疫病高效、绿色防控提供理论和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试蜡状芽孢杆菌BC98-Ⅰ（Bacillus cereus）发酵液（T1）和枯草芽孢杆菌B96-Ⅱ（Bacillus subtilis）发酵液（T2）均为本研究室自主培养。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌生长速率和抑制率测定 制备蜡状芽孢杆菌T1和枯草芽孢杆菌T2发酵液[10], 其活菌含量均为1×1012cfu·mL-1, 分别取T1和T1+T2发酵液4 mL, 加入10 mL无菌水进行稀释, 混匀, 再倒入体积为386 mL 45℃的PDA培养基中, 混匀, 制作10个平板, 每个平板20 mL, 制成芽孢杆菌发酵液100倍稀释液平板, 稀释后T1和T1+T2菌液含菌量均为1×1010cfu·mL-1。马铃薯晚疫病致病疫霉菌的培养参考毕朝位等[11]的RSA培养基培养方法, 以无菌水为空白对照；24 h后接入培养5 d、直径为4 mm的晚疫病致病疫霉菌饼, 置于28℃温箱培养, 记录菌落直径。同时挑取菌丝进行显微镜观察。

1.2.2 盆栽马铃薯的促生实验 用无菌水将枯草芽孢杆菌T2发酵液和蜡状芽孢杆菌T1、枯草芽孢杆菌T2发酵液的混合液分别稀释100和300倍, 其含菌量分别为1×1010和3.33×109cfu·mL-1, 将其分别命名为T2100、T2300和T1+T2100、T1+T2300。将田间菜园土过直径4 mm筛, 将土壤与果园有机肥（山西平陆县金牛肥业有限公司）按0.8∶1（体积比）混匀。选取无病斑的马铃薯切薯, 品种为晋薯17号, 每个薯块留1个芽眼, 将切好的薯块放置于培养盆中, 每盆放3个薯块, 覆盖约2 cm厚的菌土, 喷少量水, 盖上塑料膜以保湿。播种后20 d开始灌根施加芽孢杆菌发酵液, T2100、T2300和T1+T2100、T1+T2300处理组分别倒入10 mL稀释液, 以无菌水组为对照（CK）, 每组设3个重复, 每个重复18盆。播种后记录马铃薯出苗时间, 计算出苗率；出苗20 d后开始测量株高, 以后每隔6 d测量1次, 连续测量6次；最后1次测量完成后开始采收马铃薯, 并测定根鲜重、植株总鲜重和马铃薯产量。

1.2.3 芽孢杆菌发酵液处理对盆栽马铃薯晚疫病的防治作用 马铃薯种植同方法1.2.2, 在马铃薯出苗2周后开始采用叶片喷雾接种马铃薯晚疫病菌孢子液, 孢子含量2×106cell·mL-1, 每盆喷菌悬液20 mL, 喷雾后用塑料膜覆盖保湿24 h, 以保证菌液更好地接种于植株上。在接种菌液7、14和42 d后观测全部叶片, 以叶片为单位按下列分级标准记录观察马铃薯晚疫病的发病情况并计算防治效率[12]。

0级：无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积5%以下；3级：病斑面积占整个叶面积6%~10%；5级：病斑面积占整个叶面积11%~20%；7级：病斑面积占整个叶面积21%~50%；9级：病斑面积占整个叶面积51%以上。

1.2.4 大田马铃薯的防病实验 于2020年2—7月在晋中市榆次区东阳镇（37°33′N、112°40′E, 海拔765.6 m）进行。选取1块平地, 采用随机区组排列, 划设15个小区, 每个小区面积16 m2（4 m×4 m）, 均设置5行, 每行18穴, 每穴放入1个马铃薯块, 共90株。每处理3次重复。于播种后20 d开始灌根施用芽孢杆菌发酵液, T2100、T2300和T1+T2100、T1+T2300处理组每穴分别施用相应稀释液10 mL, 以无菌水组为对照（CK）。在马铃薯出苗后第14、第42天记录马铃薯晚疫病的发病情况, 并计算防治效率；在马铃薯收获期测量植株鲜重和马铃薯产量。

1.2.5 大田马铃薯土壤酶活性测定 根据方法1.2.4划分的小区, 按照5点取样法, 在马铃薯播种前及出苗后第7、第14和第42周分别采集0—20 cm土层的土壤样品装入样品袋, 做好标记带回实验室用于土壤过氧化物酶、脲酶、磷酸酶、蔗糖酶活性的测定, 其中, 土壤过氧化物酶、脲酶采用试剂盒测定, 试剂盒来自南京建成生物工程研究所；土壤磷酸酶和蔗糖酶活性测定方法参照周礼恺[13]的方法进行。

1.2.6 马铃薯植株高度、植株鲜重、根鲜重和产量的测定 于马铃薯成熟期（最后一次测量完成时）对各处理的马铃薯植株进行分组（区）收获, 将马铃薯植株的根部和地上部分剪开, 分别测量植株的高度、地上部植株鲜重和根鲜重；同时挖出全部马铃薯清除表面泥土后称量各组（区）马铃薯的质量, 计算产量。

1.3 数据统计

采用Excel 2013软件进行统计分析, 利用IBM SPSS 22软件进行独立样本t检验, 采用Origin 9.0进行绘图分析。

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌发酵液对马铃薯晚疫病致病疫霉菌生长的影响

由图1可知, 芽孢杆菌发酵液T2及T1+T2混合液均能显著抑制马铃薯晚疫病致病疫霉菌的菌丝生长。显微观察发现, 2种芽孢杆菌发酵液处理使致病疫霉菌菌丝短缩、畸形, 子囊孢子变形, 导致其细胞壁溶解甚至细胞破裂等。

图1 不同处理下马铃薯晚疫病病原菌的形态Fig.1 Morphology of fermentation on Phytophthorainfestans under different treatments

由图2可知, 马铃薯在接种晚疫病菌10 d后, 对照组（CK）病原菌已长满整个平皿, 而T2100、T2300和T1+T2100、T1+T2300处理的病原菌才开始生长, 表明2种芽孢杆菌发酵液对马铃薯晚疫病菌具有明显的抑制效果。由表1可知, 接种马铃薯晚疫病致病菌1周后, 对照已长满平皿, 菌落直径为8.52 cm；而T2100、T2300和T1+T2100、T1+T2300处理的菌落直径分别为1.31、1.59和1.31、1.24 cm, 均显著低于CK。接种4周后, T2100、T2300和T1+T2100、T1+T2300处理疫霉致病菌的菌落直径分别为4.88、5.44和5.16、4.60 cm；生长抑制率分别为86.21%、84.48%和85.34、87.07%。由此可见, 2种芽孢杆菌发酵液均能显著抑制马铃薯晚疫病致病菌的菌丝生长。

表1 不同处理下马铃薯晚疫病菌菌落的生长速率Table 1 Growth rate of Phytophthorainfestans under different treatments

图2 不同处理对马铃薯晚疫病菌的抑制Fig.2 Inhibition of different treatments on Phytophthorainfestans

2.2 芽孢杆菌发酵液对盆栽马铃薯的促生作用

由表2可知, 与空白对照相比, 2种芽孢杆菌发酵液处理能显著提高马铃薯出苗率（P＜0.05）。CK处理的出苗率仅74.15%, 而通过2种芽孢杆菌发酵液处理后, T2100、T2300、T1+T2100和T1+T2300处理的出苗率分别较对照提高19.96%、31.95%、10.94%和22.95%；且T2300处理显著高于T2100, T1+T2300显著高于T1+T2100。由此表明, 低水平的发酵液处理更有利于马铃薯出苗。

表2 不同处理下马铃薯的出苗率Table 2 Emergence rate of potato under different treatments

由表3可知, 芽孢杆菌发酵液处理的马铃薯株高均显著高于CK。出苗后34 d, 株高表现为T2300＞T1+T2100＞T1+T2300＞T2100。可见, 施加2种芽孢杆菌发酵液都能显著提高马铃薯株高。

表3 不同处理下马铃薯的株高Table 3 Plant height of potato under different treatments

测定马铃薯的生物量结果（表4）表明, 芽孢杆菌发酵液显著影响马铃薯的根鲜重、地上部鲜重、植株鲜重及单株产量。其中, T2300和T1+T2300处理的根鲜重显著高于CK；T2100和T2300处理的地上部和整株鲜重显著高于CK。所有芽孢杆菌发酵液处理的马铃薯单株产量均显著高于CK, 平均增产34.67%。其中, T2300、T1+T2100和T1+T2300处理又显著高于T2100处理。

表4 不同处理下马铃薯的生物量Table 4 Biomass of potato under different treatments

2.3 芽孢杆菌发酵液对盆栽马铃薯的防病作用

由表5可知, 使用芽孢杆菌发酵液后, 盆栽马铃薯在第1、第2、第6周的发病率和病情指数均显著低于CK。施用芽孢杆菌发酵液1周, 防治效率平均达73.98%；第2周的防治效率平均达83.31%；第6周的防治效率平均达76.62%。第1和第2周时, T2100和T1+T2100处理的防治效率显著高于T2300和T1+T2300处理, 且第2周时, T2300处理又显著高于T1+T2300处理；第6周时, T1+T2300处理的防治效果显著低于其他发酵液处理。综上所述, 发酵液稀释100倍时的防治效率高于稀释300倍的防治效率, 即提高芽孢杆菌发酵液的浓度在一定程度上能提高防治效率。

表5 不同处理下盆栽马铃薯晚疫病的发病率和病情指数Table 5 Incidence rate and disease index of potato late blight under different treatments in pot culture

2.4 芽孢杆菌发酵液对大田马铃薯的防病促生效果研究

由表6可知, 经芽孢杆菌发酵液灌根处理2周后, 无菌水对照组有14株发病；T1+T2300处理仅1株发病, 防治效果达90.86%, 其余3组均为零发病, 防治效果100%。随着时间延长, 灌根处理6周后, 芽孢杆菌发酵液处理组虽全部出现发病植株, 但发病率较CK显著降低, 其中, T2100处理的防治效果最高, 为78.98%；T1+T2300处理的防治效果最低, 为68.47%。大田收获后测定马铃薯植株的鲜重和产量, 结果（表6）表明, 芽孢杆菌发酵液处理的植株鲜重均显著高于CK, 平均增长率为13.64%；且马铃薯产量也均显著高于CK, 较CK平均增产15.84%。由此表明, 芽孢杆菌发酵液灌根处理对大田马铃薯也具有显著的防病促生作用。

表6 不同处理下大田马铃薯晚疫病的发病率和病情指数Table 6 Incidence rate and disease index of potato late blight under different treatments in field culture

2.5 芽孢杆菌发酵液对大田马铃薯土壤酶活性的影响

由图3可知, 施用芽孢杆菌发酵液显著影响土壤中过氧化物酶、脲酶、磷酸酶和蔗糖酶活性。与CK相比, 施用芽孢杆菌发酵液1~2周后土壤中4种酶活性均显著升高；而后酶活性呈现下降趋势, 但均显著高于CK。由此说明, 2种芽孢杆菌发酵液均能显著提高土壤酶活性。施用芽孢杆菌发酵液1周后, T2100处理的过氧化物酶、脲酶、磷酸酶和蔗糖酶活性较CK分别提高28.06%、64.29%、18.32%和57.01%；T2300处理较CK分别提高24.82%、85.71%、25.13%和52.84%；T1+T2处理组也得到类似的结果。施用芽孢杆菌发酵液2周后, 4种酶的活性继续提高, 处理组的过氧化物酶、脲酶、磷酸酶和蔗糖酶活性较CK分别平均提高134.15%、64.51%、36.67%和84.41%。施用芽孢杆菌发酵液6周后, 4种酶的活性均明显降低, 处理组的过氧化物酶、脲酶、磷酸酶和蔗糖酶活性较CK分别平均提高108.45%、46.15%、17.91%和35.15%。综上所述, 施用T1+T2混合发酵液与单独施用T2发酵液效果类似, 且不同稀释倍数的发酵液也存在类似的效果, 均能显著提升土壤酶活性；但土壤酶活性随着时间的延长又会逐渐降低。

图3 不同处理下土壤酶的活性Fig.3 Activity of soil enzyme under different treatments

3 讨论

随着我国土地流转、农业集约化经营和马铃薯主粮化战略的实施, 马铃薯种植方式和病虫害发生方式也将发生深刻变化。马铃薯成片种植面积越大, 越易造成病害的大范围发生。然而, 在马铃薯实际生产中主要依靠化学农药防治病虫害, 不仅易使病原菌产生抗药性, 还会造成环境污染, 危害人体健康。因此, 未来马铃薯病虫害的防治方向应顺应国家专业化统防统治与绿色防控相融合政策的发展趋势, 加快推进生物农药等绿色防控技术在马铃薯生产中的推广应用, 变“末端治理”为“源头防控”, 为马铃薯质量安全提供根本保障。

在马铃薯晚疫病的生物防治上, 徐雪亮等[14]报道枯草芽孢杆菌对江西马铃薯疮痂病有很好的防治效果, 但对晚疫病防效不佳；黄保全等[15]研究表明枯草芽孢杆菌在陕西对马铃薯晚疫病有很好的防病效果；Lal等[16]研究发现印楝油可用于马铃薯有机栽培中晚疫病的防治；Alaoui等[17]研究发现乳酸杆菌发酵液对马铃薯晚疫病菌有较好的防治作用。本研究采用自主研发的枯草芽孢杆菌发酵液T2及蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的混合发酵液T1+T2进行了从实验室到田间的全过程研究, 通过平皿试验发现2种芽孢杆菌发酵液均能显著抑制马铃薯晚疫病菌菌丝的生长；通过盆栽试验发现, 2种芽孢杆菌发酵液不仅能显著提高马铃薯出苗率, 还对植株具有显著的促生作用, 较CK平均提高马铃薯单产34.67%, 同时处理组植株的发病率和病情指数显著低于CK, 第1周的平均防治效率达73.98%, 第2周达83.31%, 第6周达76.62%；大田系统试验表明, 2种芽孢杆菌发酵液第6周的防治效果最低为68.47%, 最高为78.98%, 且均能显著提高马铃薯产量, 较CK平均增产15.84%, 另外, 2种芽孢杆菌发酵液还能显著提高土壤中过氧化物酶、脲酶、磷酸酶和蔗糖酶的活性。土壤酶活性是微生物功能的一种表现, 微生物根据其需求和底物的可用性来合成酶, 将有机大分子分解为可供植物吸收的单体, 从而影响土壤中营养物质的转化。因此, 下一步应对芽孢杆菌发酵液作用下的土壤养分和土壤微生物菌群进行动态研究, 分析该芽孢杆菌发酵液对马铃薯促生作用及晚疫病防治的具体作用机制。