NaOH预处理对青稞秸秆厌氧发酵特性的影响

柳丽, 杜中平, 李屹, 陈来生, 韩睿

（青海大学农林科学院, 青海省蔬菜遗传与生理重点实验室, 西宁 810016）

青稞是我国青藏高原的特色优良作物, 具有适应性强、抗逆性强和易栽培等优点, 在高寒地区的粮食种植中占据重要地位, 现已成为青藏高原农牧民的主要粮食和经济来源[1]。目前, 青藏高原常年种植青稞面积已达300多万hm2, 并且逐年增加[2]。随着青稞种植面积的扩增, 其收获后的废弃秸秆也在不断增多, 仅青海省的秸秆年产量就达30万t, 秸秆资源量十分丰富。青稞秸秆中富含氮、磷、钾等多种营养元素和有机物质, 具有较高的再利用价值[3]。然而, 目前除部分用作饲料外, 更多的却未得到有效利用, 就地填埋、随意焚烧的现象仍普遍存在, 造成极大的资源浪费和环境污染。

厌氧发酵是秸秆等农业废弃物资源化利用的有效技术手段, 不仅能够有效解决废弃物堆弃问题, 还能生产出沼气等能源物质。然而秸秆中紧密的木质纤维素结构严重阻碍了厌氧发酵底物的消化分解, 导致秸秆的生物可降解性不高[4]。因此, 有必要对青稞秸秆进行适当的预处理。在众多对秸秆的化学预处理方法中, NaOH是一种常见、廉价且效果显著的预处理试剂, 现已被广泛应用于各种秸秆厌氧发酵的预处理[5-7]。覃国栋等[8]研究发现, NaOH预处理可以降解稻草中半纤维素组分, 显著提高甲烷产量。Zhu等[9]发现5%NaOH固态预处理玉米秸秆的产气量最高, 为372.4 L·kg-1, 较对照提高了37%。Liang等[10]和Rezaei等[11]分别发现4% NaOH和1% NaOH预处理对玫瑰茎秆和黑麦秸秆厌氧消化效果较好, 产气量分别达到了117.7和121 mL·g-1。现阶段, 我国关于秸秆厌氧消化的研究大多集中在粮食作物秸秆上, 特别是对小麦[12]、玉米[13]和水稻[14]等作物的秸秆研究较多, 青稞秸秆诸多理化性质类似于小麦秸秆, 却鲜有报道。因此, 本文以废弃的青稞秸秆作为发酵底物, 研究不同NaOH预处理条件对青稞秸秆厌氧发酵性能的影响, 以期探讨NaOH在青稞秸秆厌氧发酵应用中的可行性, 为青藏地区青稞秸秆资源化利用提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

青稞秸秆取自青海大学农林科学院实验地。自然条件下风干后, 用粉碎机粉碎至粒径2 cm左右, 于阴凉通风处保存备用。接种物取自青海知源特色农业有限责任公司以牛粪为原料发酵稳定的农用沼气池。发酵原料和接种物的特性见表1。

表1 原料与接种物特性Table 1 Characteristics of raw materials and inoculum

1.2 试验方法

1.2.1 青稞秸秆NaOH预处理 试验设置4种不同NaOH水平(1%、3%、5%和7%)和3个处理时间(6、12、24 h)。将不同水平梯度的NaOH溶液分别添加到青稞秸秆中(控制物料含水率为70%左右), 充分搅拌混匀后放入广口瓶内, 密封并置于室温下处理。处理完成后用去离子水冲洗至中性, 60℃烘干备用。同时采用未经任何处理的青稞秸秆作为对照（CK）。

1.2.2 批式厌氧消化试验 厌氧发酵试验采用碧普华瑞环境技术(北京)有限公司的全自动甲烷潜力测试仪MultiTalent 203。每个发酵瓶内按设计好的比例(2∶1)分别加入青稞秸秆和接种物, 并设置只添加接种物污泥的空白对照, 各处理组总量为400 g。每组设置3个重复。全部添加后, 将发酵瓶密封并置于恒温(35±0.5)℃水浴锅中。每间隔3 min搅拌1次, 每次搅拌时长为0.5 min。从发酵24 h开始, 每4 d采集1次发酵液样品用以测定pH、氨氮、挥发性脂肪酸(volatile fatty acids, VFAs)和化学需氧量(chemical oxygen demand, COD)。

1.3 测定项目及方法

总固体(total solid, TS)和挥发性固体(volatile solid, VS)采用烘干法测定, 其中, 总固体于烘箱105℃烘24 h, 挥发性固体于马弗炉550℃灼烧3 h；pH用pH计(pHS-2F型)测定；氨氮采用苯酚次氯酸钠比色法测定[15]；挥发性脂肪酸(VFAs)采用分光光度法测定[16]；化学需氧量(chemical oxygen demand,COD)采用快速消解分光光度法测定[17]；木质纤维素含量由纤维洗涤剂法测定[18]；傅里叶红外光谱(frustrated total internal reflection,FTIR)采用固体溴化钾压片法进行分析[19]。

1.4 动力学分析

采用修正的Gompertz动力学模型对不同预处理青稞秸秆发酵过程的甲烷产量进行数据拟合[16]。

式中,P为累积甲烷产量(mL·g-1)；Pmax为产甲烷潜力(mL·g-1)；Rmax为最大产甲烷速率(mL·g-1·d-1)；t为发酵时间(d)；λ为产甲烷延滞期(d)；e是常数, exp(1)=2.718 3。

1.5 数据分析

采用SPSS软件分析数据, 采用邓肯多重比较法, 当P＜0.05时, 数据之间具有显著性差异；使用Origin 2018制图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对青稞秸秆厌氧发酵特性的影响

2.1.1 日产甲烷量与累积甲烷产量 不同处理组日产甲烷量变化如图1所示。在35 d厌氧发酵过程中, 不同处理组的日产甲烷量均呈现先升高后降低的趋势, 并出现1~2个产甲烷高峰, 均集中在前7 d。其中, 3% NaOH-24 h处理组日产甲烷量最大, 达到了143.73 mL·d-1；其次是1% NaOH-24 h处理组, 为130.53 mL·d-1。同时, 发酵前期CK产气缓慢, 日产甲烷量低于所有NaOH处理组, 说明NaOH预处理能够加快厌氧发酵的启动速率。

图1 不同处理组的日产甲烷量Fig.1 Daily methane production in different treatments

由图2可知, 与CK相比, 各NaOH处理组累积甲烷产量均显著增加(P＜0.05), 说明NaOH预处理可以提高青稞秸秆厌氧发酵的产甲烷能力。同一时间段内, 各处理组的累积甲烷产量均随着NaOH水平的增大呈现先升高后降低的趋势, 5%NaOH处理组高于其他3个NaOH处理组。相同NaOH水平下, 青稞秸秆预处理12 h的累积甲烷产量均高于预处理时间为6和24 h的累积甲烷产量。其中, 5%NaOH-12 h处理组获得了最高累积甲烷产量, 达到250.03 mL·g-1, 较CK显著提高了67.92%；其次是5%NaOH-24 h和5%NaOH-6 h组, 累积甲烷产量分别为242.13和240.85 mL·g-1, 分别较CK显著提高了62.61%和61.75%。T90表示物料累积甲烷产量达到总甲烷产量90%时需要的时间。由表2可知, CK的T90为22 d, 各NaOH处理组的T90均在13~17 d之间, 说明NaOH预处理能够缩短青稞秸秆的发酵周期, 提高发酵效率。

图2 不同处理组的累积甲烷产量Fig.2 Cumulative methane production in different treatments

2.1.2动力学分析 不同处理组累积甲烷产量的Gompertz方程拟合曲线和拟合结果如表2所示。R2可以衡量动力学方程的拟合度, 当R2大于0.990时, 拟合结果较好。由表2可知, 各处理组的R2均大于0.990, 说明拟合效果较好, 并且NaOH预处理组的产甲烷潜力和最大产甲烷速率均大于CK, 说明NaOH预处理能够提高青稞秸秆的产甲烷潜力和速率。所有NaOH预处理组的产甲烷延滞期均小于CK, 说明NaOH预处理可以加快发酵的启动。

表2 不同处理组的消化时间T90及Gompertz模型的动力学参数Table 2 Digestion time T90 and kinetic parameters of Gompertz model in different treatments

2.2 不同处理发酵液pH、氨氮、挥发性脂肪酸和化学需氧量的变化

由 图3可 知, CK的pH在7.58~7.78之 间, NaOH处理组的pH在7.17~8.01之间, 均属于产甲烷菌正常生长的范围。相比CK, NaOH处理组pH变化波动更大, 这表明NaOH处理组的有机酸产生和消耗更快。整体而言, 1~5 d内, 各处理组的pH明显下降, 均在第5天出现最低值, 说明发酵系统正处于水解酸化的启动阶段, 有机酸大量产生；第5天后, pH又迅速上升并逐渐趋于稳定, 表明产甲烷菌开始活跃, 大量消耗发酵前期的酸性物质产生甲烷。

图3 不同处理组pH变化Fig.3 Changes of pH value in different treatments

由图4可知, CK的氨氮含量在714.27~877.40 mg·L-1范围内, NaOH处理组的氨氮含量在717.33~972.80 mg·L-1范围内, 高于CK处理组。说明NaOH处理组的有机物分解更快, 但各处理组的氨氮含量均未超过1 000 mg·L-1, 未对体系造成氨抑制。同一时间段内, 水平较低(1%、3%)的NaOH处理组氨氮含量峰值高于水平较高(5%、7%)的NaOH处理组, 但各处理组的氨氮含量整体变化趋势相差不大, 均呈现先上升再降低后趋于平稳的趋势, 且峰值均出现在13 d之前, 说明该时期微生物对底物的降解最快。

图4 不同处理组的氨氮含量变化Fig.4 Changes of ammonia nitrogen concentration in different treatments

由图5可知, CK的VFAs含量 在1 781.15~3 075.84 mg·L-1范围内, NaOH处理组的VFAs含量在1 102.77~4 973.54 mg·L-1范围内, 均没有对体系产生抑制作用。其中, 预处理时间长的NaOH处理组(12、24 h)VFAs含量峰值高于预处理时间短的NaOH处理组(6 h), 说明预处理时间长的处理组在发酵前期能产生更多的有机酸。但在整个发酵周期中, 所有处理组的VFAs含量变化趋势却无明显区别, 均在发酵第5天达到最大值后逐渐降低并趋于稳定。这说明发酵前期主要是产酸阶段, 发酵后期则表现为有机酸的产生和消耗达到平衡。

图5 不同处理组的挥发性脂肪酸含量变化Fig.5 Changes of VFAs concentration in different treatments

不同处理组发酵过程中COD的变化情况如图6所示。随着反应的进行, 各处理组的COD均整体呈现先升高再降低后趋于稳定的趋势, 与氨氮含量和VFAs含量变化趋势相似。此外, 各处理组的COD峰值均集中在5~9 d。结合图2可知, 累积甲烷产量较高的处理组COD峰值也相对较高, 同一时间段内, 3%、5% NaOH处理组的累积甲烷产量要高于其他处理组, 而COD峰值也相对较高；其中, 5% NaOH-12 h处理组最高, 为9 695.42 mg·L-1, 该处理组累积甲烷产量也最高, 为250.03 mL·g-1。

图6 不同处理组的化学需氧量变化Fig.6 Changes of COD in different treatments

2.3 不同处理青稞秸秆傅里叶红外光谱图分析

为更好地了解预处理前后青稞秸秆木质纤维素组分的变化情况, 对各处理组进行傅里叶红外光谱图(FTIR）分析。由图7可知, 预处理前后的红外光谱图形状大致相同, 说明NaOH预处理并未改变青稞秸秆的官能团及化学键种类, 而是改变了其木质纤维素的内部结构, 表现在某些峰吸收强度的不同。表3呈现了红外光谱中不同波长对应的基团种类及青稞秸秆木质纤维组分变化情况, 波数3 330 cm-1附近强而宽的吸收峰主要来自羟基(O-H)的拉伸振动, 是木质素吸收光谱峰[20]。相比CK, 各处理该吸收峰强度明显降低, 说明NaOH预处理可降解青稞秸秆中的木质素, 导致秸秆基质孔隙度增加。波数2 854和2 910 cm-1附近较强而尖锐的吸收峰是由于C-H中甲基和亚甲基对称和反对称拉伸振动引起的, 该峰代表纤维素的吸收强度[21]。各预处理后该吸收峰相比CK明显增强, 说明NaOH预处理增加了纤维素含量。在1 621 cm-1附近出现的是羰基键和苯环的吸收峰, 该峰代表半纤维素和木质素的吸收强度。处理后峰强度减弱, 表明青稞秸秆中半纤维素和木质素得到有效去除[22]。

图7 不同处理组青稞秸秆的红外光谱Fig.7 Infrared spectra of hulless barley straw treated in different treatments

表3 不同波长对应的基团种类及纤维组分变化情况Table 3 Changes of group types and fiber components corresponding to different wavelengths

2.4 不同处理青稞秸秆组分含量变化

不同处理组青稞秸秆中的木质纤维素变化情况如表4所示。与CK相比, 大多数NaOH处理组的木质素和半纤维素含量均显著降低(P＜0.05), 二者降解率分别为12.83%~64.34%和0.96%~30.30%, 木质素降解率高于半纤维素。同一时间段内, 7%NaOH处理后的木质素降解率均高于其他处理组。其中, 7%NaOH-6 h的木质素降解率最高, 达到64.34%, 但7% NaOH各处理的累积甲烷产量却低于5%NaOH各处理(图2), 说明过高的碱含量会影响体系的产甲烷能力。与木质素和半纤维素被降解结果不同, 各NaOH处理组的纤维素含量均显著提高(P＜0.05), 相比CK提高了13.37%~39.31%。综上, NaOH预处理增加了青稞秸秆中纤维素含量, 并有效降解了木质素和半纤维素, 其中对木质素的降解效果更好。表明NaOH预处理可以在一定程度上提高青稞秸秆的生物降解率。

表4 不同处理组青稞秸秆木质纤维素含量Table 4 Lignocellulose content of hulless barley straw in different treatments （%）

3 讨论

NaOH是一种常见且价格低廉的化学预处理试剂, 能够提升玉米[9]、稻草[8]、黑麦[11]、芦苇[23]、甘蔗叶[6]和玫瑰茎秆[10]等多种木质纤维素类废弃物的厌氧发酵效率。本研究中, NaOH预处理对青稞秸秆厌氧发酵也发挥了较好的作用, 显著提高了其产甲烷性能(P＜0.05)。相比CK, 各NaOH处理组的累积甲烷产量提高了14.59%~67.92%, 其中5% NaOH处理12 h获得了最高累积甲烷产量, 为250.03 mL·g-1。有研究表明, 芦苇经过不同含量NaOH预处理后的最高累积甲烷产量为237 mL·g-1[23]；麦糠经过6% NaOH处理获得的最大产甲烷潜力为199.5 mL·g-1[24]；玫瑰茎秆经过NaOH预处理后的累积甲烷产量在81.8~117.7 mL·g-1[10]。说明青稞秸秆的发酵潜力高于多数木质纤维素类废弃物, 是良好的发酵原料。同时, 各NaOH处理组达到T90的时间相比CK均缩短, 并且对于表示产气延滞期的λ值, 各NaOH处理组也均小于CK。说明NaOH能够缩短青稞秸秆厌氧发酵周期, 加快发酵系统的启动。已有研究也能够证实NaOH的这一作用, 李桃等[25]研究表明NaOH预处理能够缩短废弃香蕉秸秆厌氧发酵的启动时间；罗娟等[6]和Ivo等[23]发现NaOH预处理能够将甘蔗叶和芦苇的T90分别缩短3~5和13 d。

本研究发现, NaOH预处理能够有效降解青稞秸秆木质素和半纤维素, 尤其是对木质素的降解效果较好, 这与前人的研究结果一致[6,9,13,26]。可能是因为NaOH碱性较强, 能够迅速破坏木质素与多糖之间的化学键, 促使木质素结构断裂, 从而达到降解的目的[20]。同时, NaOH预处理增加了青稞秸秆中纤维素含量, 由于碱预处理能够引起木质纤维素聚合物发生解聚, 使得更多被木质素和半纤维素包裹的纤维素暴露, 从而造成纤维素含量增加[27-28]。

研究还发现, NaOH预处理能够维持发酵系统的稳定性。通常来讲, pH、氨氮和VFAs均是衡量发酵系统是否稳定的指标。pH在6.8~7.8之间最适合发酵, 过高(＞8.5)或过低(＜6.4)均会抑制发酵微生物活性[29]；适量的氨氮可以为发酵体系提供氮源, 缓解酸抑制现象, 含量过高则会抑制产甲烷菌的生长, 影响发酵效果[15,30]；VFAs可以被产甲烷菌利用产生甲烷, 但VFAs累积过多(＞5 000 mg·L-1)会造成系统酸化[7,31]。本研究中, 所有NaOH处理组的pH、氨氮和VFAs含量值均保持在发酵系统的稳定范围内, 没有产生抑制现象。此外, COD主要包括水解产生的有机物质和未能被利用的VFAs等。一般来说, COD水平越高越有利于微生物的生存和繁殖[17,32], 本研究中COD水平高的处理组对应的累积甲烷产量也较高, 符合上述规律。综上所述, 适宜水平的NaOH预处理不仅能够增加青稞秸秆的甲烷产率、缩短发酵周期、维持发酵的稳定性, 还能够节约预处理试剂的成本, 是青稞秸秆等木质纤维素类废弃物厌氧发酵的有效预处理手段。