酵米面和银耳及其制品中毒黄素和热诚菌素的检测方法的建立及稳定性比较

汪辉，邓楠，崔晓娇,2，陈先桂，王璐，袁圆,2，陈高超，周策睿

（1.长沙市食品药品检验所，国家酒类产品质量检验检测中心（湖南），湖南长沙 410016）

（2.食品安全监测与预警湖南省重点实验室，湖南长沙 410111）

随着人们生活质量的提高，食品安全问题日益受到大众的关注。近来年，细菌性食物中毒时常发生，其中关于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）中毒事件较为突出[1-6]。2020年10月，黑龙江鸡西市发生的“酸子汤”（酵米面）事件造成9名中毒者全部死亡，经当地卫健部门定性为由椰毒假单胞菌污染引起的食物中毒事件。银耳如果储存不当或时间过长，也易受该菌污染而引起中毒[1,5]。引起中毒的原因是唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）产生了米酵菌酸和毒黄素[4,7-9]。总体来说，米酵菌酸的毒性较大，关注度较高，检测方法较成熟，且有食品安全国家标准检测方法[10]。但毒黄素（见图1）的毒理学表明：小鼠静脉口服毒黄素L D50为8.39 mg/kg[8]，毒性也较大，对人、动物、许多微生物及植物皆有毒性作用[11-13]。关于其作用部位、致毒机理的研究也有不少的报道[14-16]。热诚菌素是毒黄素的同分异构体（见图1），和毒黄素一样，拥有嘧啶并三嗪环骨架结构，且在一定化学条件下两者能够相互转化[17]。其毒理学表明：仓鼠腹腔注射LD50为11.2 mg/kg。由于两者毒性均较高，中毒后需尽快解毒，所以其稳定性研究很有必要，但目前该研究尚属空白。因此，为了预防唐菖蒲伯克霍尔德氏菌中毒事件的发生以及后期中毒的鉴定和分析，需建立酵米面和银耳及其制品中的毒黄素和热诚菌素的测定方法，并对目标物进行稳定性考察。

图1 毒黄素和热诚菌素的结构式Fig.1 Structural formulas of toxoflavin and fervenulin

目前，毒黄素和热诚菌素的稳定性研究较少，关于毒黄素的检测方法较多，关于热诚菌素的检测方法较少，主要有薄层色谱法[18]、分光光度法[19,20]、高效液相色谱法[21]、高效液相-质谱法[7]及流动注射化学发光法在线监测法[22]等。这些方法大多应用于细菌培养液中高浓度毒黄素的测定，不适用于食品中低含量毒素的测定。张伟等[7]采用了较昂贵的超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱，一般实验室难以实现，且对人员操作要求较高；周鹏等[23]和王朝霞等[24]建立的高效液相色谱法采用低波长检测，可能存在一定干扰，且灵敏度有待提高。本文以酵米面和银耳及其制品为研究对象，建立了一种测定酵米面和银耳及其制品中毒黄素和热诚菌素的高效液相色谱法。同时，对毒黄素和热诚菌素的稳定性进行考察，以期为后期解毒或避毒研究提供参考。该方法前处理简单，干扰较小，准确度和灵敏度较高，具有一定的应用价值，可以为毒黄素和热诚菌素的致毒机理及解毒方法的研究提供新的技术支撑，同时也可以更好地应对和处理此类食品安全事故，以寻找抢救的最佳方案，减少死亡率。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；UV-2450紫外分光光度计，日本岛津公司；Milli-Q Direct 8超纯水仪，德国MERCK公司。

毒黄素纯度为97.22%，热诚菌素纯度为98.17%，香港标准物质研究所；GBW(E)130417紫外分光光度计用溶液标准物质（重铬酸钾溶液），四川中测标物科技有限公司；甲醇为色谱纯，德国MERCK公司；甲酸为色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，氨水为色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；食用小苏打（碳酸氢钠），长沙智腾食品贸易有限公司；食用纯碱（碳酸钠），武汉成达食品有限公司；实验用水为Milli-Q Direct 8超纯水仪制得的超纯水。

1.2 标准溶液配制

分别精确称取毒黄素和热诚菌素各10 mg于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到浓度为400 mg/L标准储备液，冷冻条件下（-18 ℃）可保存5个月。采用体积分数0.1%甲酸溶液配制成标准系列使用液，供高效液相色谱分析。

1.3 波长的选择

采用不接色谱柱直接进样，高效液相色谱仪二极管阵列检测器对毒黄素和热诚菌素在210～600 nm进行光谱扫描，根据扫描结果设置合适波长进行标准溶液和样品溶液测试，根据测试结果选择波长。

1.4 进样溶剂优化

采用0.1%甲酸水、0.1%甲酸水-甲醇（95:5，V/V）、0.1%甲酸水-甲醇（90:10，V/V）、0.1%甲酸水-甲醇（80:20，V/V）和0.1%甲酸水-甲醇（70:30，V/V）配制20 mg/L混合标准溶液，考察进样溶剂对目标物的色谱峰形的影响。

1.5 提取溶剂的选择

毒黄素和热诚菌素溶于甲醇和水，本试验参考流动相考察采用0.1%甲酸水和甲醇提取样品，观察提取时样品状态和后期样品溶液过滤状态。

1.6 色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相：A为0.1%甲酸水，B为甲醇，梯度洗脱程序：0～5.00 min，6% B，5.00～10.00 min，6% B～50% B，10.00～12.00 min，50% B，12.01 min，6% B；毒黄素检测波长：398 nm，热诚菌素检测波长：338 nm，柱温：35 ℃；进样量：80 µL。

1.7 样品前处理

取10 g酵米面（取样前混匀）或5 g银耳罐头（取样前匀浆）于50 mL离心管中，加入10 mL 0.1%甲酸超声提取10 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液于25 mL容量瓶中，重复提取一次，合并上清液，用0.1%甲酸溶液定容至刻度，混匀，取溶液过0.45 µm滤膜，待测。

取5 g鲜银耳（取样前粉碎至颗粒状）或干银耳（取样前粉碎至粉末状）于50 mL离心管中，加入25 mL甲醇超声提取10 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液1 mL于10 mL刻度塑料离心管中，45 ℃氮吹至近干，0.1%甲酸溶液定容至1 mL，涡旋复溶1 min，取溶液过0.45 µm滤膜，待测。

1.8 方法学验证

标准曲线、检出限和定量限：配制浓度为0.20、0.40、0.80、1.00、2.00、4.00、8.00、10.00、20.00 mg/L的毒黄素和热诚菌素混合标准工作液，每个浓度平行测定3次。以3倍信噪比计算检出限，10倍信噪比计算定量限。

加标回收率和精密度：在空白酵米面中添加0.50、1.00、5.00 mg/kg的毒黄素和热诚菌素混合标准溶液，在空白鲜银耳、干银耳和银耳罐头分别添加1.00、2.00、10.00 mg/kg的毒黄素和热诚菌素混合标准溶液，按照1.4节方法进行前处理和1.2节仪器条件进行测定，每个添加水平浓度平行测定6次，计算加标回收率和精密度。

专属性试验：毒黄素和热诚菌素是水溶性黄色毒素。本试验配制了实验室常测的水溶性橙黄色色素（酸性橙1、酸性橙2、碱性橙2、碱性橙22、柠檬黄、日落黄）和生物毒素（黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲毒毒素A）标准溶液，采用建立的方法进行分析，考察对目标分析物有无影响。

1.9 稳定性比对

采用甲醇配制100 mg/L的毒黄素和热诚菌素的标准储备液，分别采用0.1%甲酸，1%甲酸和0.1%氨水配制10 mg/L的毒黄素和热诚菌素的标准使用液。在相应的环境中分别保存0、1、2、3、4、5个月，采用紫外可见分光光度计测定毒黄素（258 nm和398 nm）和热诚菌素（240 nm和338 nm）的吸光度（见表1）。每次测定前采用GBW(E)130417紫外分光光度计用溶液标准物质（重铬酸钾溶液）对紫外分光度计进行透射比测定。

表1 毒黄素和热诚菌素的稳定性试验Table 1 Stability tests of toxoflavin and fervenulin

1.10 数据处理

本文化合物结构式采用ACD/Labs releasee：12.00软件绘图，其他绘图均采用OriginPro 2018C(64-bit)SR1 b9.5.195软件进行数据处理。

2 结果与讨论

2.1 波长的选择

毒黄素在258 nm和398 nm有较大吸收峰，热诚菌素在240 nm和338 nm有较大吸收峰，且两种目标物在低波长的吸收峰均高于高波长吸收峰（见图2）。在分析标准溶液时，采用对应的低波长测定时两种目标物的灵敏度均高于高波长（见图3），但采用低波长分析样品溶液时，由于大多数化合物在低波长均有一定的吸收，且样品基质较复杂，杂质对目标物的测定干扰较严重。当波长为398 nm，毒黄素能获得较高的灵敏度，当波长为338 nm时，热诚菌素能获得较高的灵敏度，且在这两种波长下目标化合物的干扰较小[23]。因此，本方法选择在398 nm波长下测定毒黄素和在338 nm波长下测定热诚菌素。

图2 毒黄素和热诚菌素的光谱图Fig.2 Spectrograms of toxoflavin and fervenulin

图3 4种加标样品溶液在不同波长下的色谱图Fig.3 Chromatograms of 4 kinds of spiked sample solutions at different wavelength

2.2 进样体积的选择和进样溶剂优化

本试验使用的进样器的进样范围为0.1～100 µL，为得到更低的检出限值，又避免采用进样器极限值，最终选用较大体积即80 µL作为进样体积[25]。进样溶剂对目标物的色谱峰形影响较大，且对毒黄素的色谱峰形的影响大于热诚菌素（见图4）。当溶剂为0.1%甲酸水和0.1%甲酸水-甲醇（95:5，V/V）时，两种目标物的峰形对称且尖锐。当甲醇含量≥10%时，毒黄素峰形开始出现展宽，当甲醇含量≥20%时，热诚菌素的峰形也开始出现展宽，当甲醇含量为30%时，毒黄素出现了肩峰。因此，选用0.1%甲酸水作进样溶剂，操作较简便。

2.3 提取溶剂的选择

图4 不同溶剂配制的毒黄素和热诚菌素标准溶液色谱图Fig.4 Chromatograms of toxoflavin and fervenulin n standard solution prepared with different solvent

采用0.1%甲酸水时，较适合酵米面和银耳罐头中目标物的提取，提取率大于85%；但干银耳和鲜银耳会吸水，提取溶液较粘稠，后期无法通过滤膜；而采用甲醇时，适合所有类型的样品中目标物的提取，提取率大于80%。考虑本实验采用有机溶剂提取，后期需要浓缩后置换溶剂，使前处理过程变得复杂，最终选用0.1%甲酸水溶液提取酵米面和银耳罐头，甲醇溶液提取干银耳和鲜银耳。

表2 方法的检出限、定量限、线性范围、回归方程和R2Table 2 LODs, LOQs, linear ranges, regression equations and R2 of this method

2.4 标准曲线、检出限和定量限

以质量浓度（mg/L）为横坐标，平均峰面积为纵坐标绘制标准曲线，两种目标物在0.20～20.00 mg/L呈良好线性。酵米面中的毒黄素和热诚菌素的检出限均为0.15 mg/kg，定量限为0.50 mg/kg；银耳及其制品中的毒黄素和热诚菌素的检出限均为0.30 mg/kg，定量限为1.00 mg/kg，具体结果见表2。

2.5 加标回收率和精密度

回收率试验结果表明：四种样品基质中毒黄素的加标回收率为79.77%～104.02%，相对标准偏差为1.50%～8.91%；热诚菌素的加标回收率为93.31%～104.36%，相对标准偏差为0.96%～5.77%，具体结果见表3。

2.6 专属性试验

生物毒素（黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲毒毒素A）在338 nm和398 nm波长处无吸收，在色谱图中无响应，橙黄色色素（酸性橙1、酸性橙2、碱性橙2、碱性橙22、柠檬黄、日落黄）虽有响应，但在目标物出峰处均无干扰（见图5），说明该方法有一定的抗干扰能力，专属性较好。

图5 干扰试验的色谱图Fig.5 Chromatogram of interference test

2.7 实际样品分析

应用建立的方法测定4个酵米面、6个干银耳、2个银耳罐头，均未检出毒黄素（＜检出限）和热诚菌素（＜检出限），测定10个鲜银耳，2个鲜银耳样品检出毒黄素，含量范围为1.50～7.77 mg/kg；3个样品鲜银耳检出热诚菌素，含量范围为1.01～3.41 mg/kg。典型阳性样品色谱图和光谱图见图6。

表3 回收率试验和精密度Table 3 Recovery and precision test (n=6)

图6 典型阳性样品色谱图和光谱图Fig.6 Chromatograms and spectrograms of typical positive samples

2.8 与现有方法的对比

本方法与现在方法进行了对比，结果见表4。张伟等[7]建立的超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱串联质谱法（UPLC-MS/MS/Q-Trap）检出限能达到0.004 µg/kg，但该设备较昂贵，对检测人员要求也较高，一般实验室难以实现；刘倩妤等[22]建立的流动注射化学发光法灵敏度也较高，方法检出限可达到0.01 mg/L，但分析对象仅适用于饮用水，且只能检测毒黄素；周鹏等[23]建立的高效液相色谱法（HPLC）虽然分析了三种目标物，但采用低波长检测样品时会导致基线较高，方法检出限仅为3 mg/kg，且分析的新鲜银耳样品为已泡发的样品，有一定的局限性；王朝霞等[24]建立高效液相色谱法（HPLC），虽同样采用低波长检测，但前处理采用液液萃取方法，可以一定程度上净化样品，从而使方法灵敏度有了一定的提高，检出限为0.8 mg/kg，但方法不适用于酵米面和银耳及其制品的分析；本方法针对酵米面、鲜银耳、干银耳和银耳罐头样品特性，采用不同的提取溶剂进行提取，并克服溶剂效应，采用大体积进样[25]，利用毒黄素和热诚菌素的高波长作为检测波长，大大降低了杂质的干扰，同时提高方法灵敏度，方法检出限相对于周鹏等建立的方法降低了一个数量级，即0.15 mg/kg。本文采用梯度洗脱排除了等度洗脱会导致后出峰组分色谱峰展宽和杂质富集色谱柱的影响，大体积进样和高波长检测有效地解决了复杂基质的干扰，大大提高了方法的稳定性和灵敏度。经方法验证和实际样品测定，本方法切实可行，效果令人满意。

表4 与现有方法的对比Table 4 Comparison with existing methods

2.9 稳定性比对

采用GBW(E)130417紫外分光光度计用溶液标准物质（重铬酸钾溶液）对紫外分光光度计进行透射比测定，每次三次平行测定的透射比允许误差符合I级标准，且连续5个月的透射比的RSD小于0.65%，说明仪器的稳定性较好[26]。稳定性试验结果（见图7）表明：采用甲醇配制100 mg/L的标准储备液，在冷冻条件下（-18 ℃），两种目标化合物5个月内的吸光值相对标准偏差分别为0.90%和0.58%，说明在此条件下，毒黄素和热诚菌素较稳定；采用0.1%甲酸（V/V）和1%甲酸（V/V）配制10 mg/L的使用液，毒黄素的吸光值会随着时间变长而变小，5个月内降解至26%以下，且采用1%甲酸（V/V）配制的标准溶液降解速度快于0.1%甲酸（V/V），而热诚菌素在5个月内吸光值的相对标准偏差均小于3.18%，说明在此条件下，热诚菌素较稳定。另外，同一浓度毒黄素和热诚菌素在高波长下吸光值较低波长的吸光值稳定，说明在高波长下测定两种目标物偏差较小；采用0.1%氨水（V/V）配制10 mg/L的使用液颜色较采用0.1%甲酸（V/V）配制10 mg/L的使用液浅，其中毒黄素的吸光值不到后者的40%，热诚菌素的吸光值不到后者的20%，说明在此条件下，毒黄素和热诚菌素极不稳定，易发生降解。

根据毒黄素和热诚菌素在碱性条件下不稳定的现象，我们采用0.1%、0.5%、1.0%、2.0%食用小苏打（m/m）和0.1%、0.5%、1.0%、2.0%食用纯碱（m/m）分别配制毒黄素和热诚菌素溶液进一步实验，发现采用食用小苏打溶液（m/m）配制的毒黄素变化不明显，热诚菌素的吸光值（338 nm）变为0.1%甲酸（V/V）配制的热诚菌素溶液的85%左右，且随着溶液浓度升高变化不显著；采用食用纯碱（m/m）配制的两种目标物溶液颜色迅速变浅，其中采用0.1%食用纯碱（m/m）配制的毒黄素，吸光值（398 nm）为0.1%甲酸（V/V）配制的毒黄素溶液的18.28%，随着食用纯碱（m/m）的浓度增大，降解比例随之降低，当浓度为1%时，降解比例达到12.48%；而热诚菌素的降解更为明显，当采用0.1%食用纯碱（m/m）配制的热诚菌素，吸光值（338 nm）为0.1%甲酸（V/V）配制的热诚菌素溶液的1.11%，且随着食用纯碱（m/m）浓度增加，变化不显著（见图8）。因此，我们在日常生活中采用1%食用纯碱（m/m）清洗或浸泡相关食品，可以大幅度降解毒黄素和热诚菌素，从而降低中毒的风险。

图7 毒黄素和热诚菌素在不同溶液和不同储存环境中的稳定性Fig.7 Stability of toxoflavin and fervenulin in different solution and storage environment

图8 毒黄素和热诚菌素在不同质量浓度的食用小苏打和纯碱溶液中降解至原浓度的比例Fig.8 The ratio of toxoflavin and fervenlulin degraded to their original concentrations in different concentrations of edible baking soda and sodium carbonate

3 结论

本文以酵米面和银耳及其制品为研究对象，采用C18色谱柱对目标物进行分离，在其高波长下进行分析，建立测定毒黄素和热诚菌素的高效液相色谱法。采用该方法对样品进行测定，经保留时间和光谱图定性，外标法定量，检测出部分鲜银耳中含有目标物。该方法与现有的方法比较，前处理简单易行，干扰较小，准确度和灵敏度较高，可适用于酵米面、银耳及其制品中毒黄素和热诚菌素的定性定量分析，可为食品安全监管和风险监控提供技术支撑。目标物的稳定性研究表明，毒黄素和热诚菌素在碱性条件下易发生降解，日常生活中，采用1%食用纯碱（m/m）清洗或浸泡相关食品，可能会降低毒黄素和热诚菌素中毒的风险。毒黄素在酸性条件下会随着时间变长慢慢降解，热诚菌素在酸性条件下稳定性较好。稳定性对比结果可为后期的解毒（如果降解产物毒性小）或避毒（如果降解产物毒性大）提供了有力的参考。