天麻软腐病相关细菌的分离鉴定*

于莺曼，张 鹏，刘建伟，杨石美**

（1.华南师范大学 生命科学学院，广东 广州 510631；2.中国科学院昆明植物研究所，中国西南野生生物种质资源库，云南省真菌多样性与绿色发展重点实验室，云南 昆明 650204）

天麻（Gastrodia elata）是一种异养兰科植物，依靠蜜环菌（Armillaria mellea）分解木材并利用其释放出的营养而生存。天麻入药已有2 000多年历史，是一种重要的传统中药材。然而在天麻主产区存在连作障碍严重、药材减产和有效成分降低等问题，很大程度上影响天麻产业的可持续发展。病害是影响中药材产量和品质的重要因素，天麻最常见的病害有腐烂病、黑心病、白绢病、软腐病等侵染性病害，以及天麻生存环境不适或天麻与蜜环菌之间营养失衡导致的生理性病害[1-2]。研究发现侵染性病害主要由真菌、细菌、病毒等引起[3]，微生物群落结构变化也被认为是天麻发病的重要原因[4]。有研究认为细菌是引起天麻软腐病的主要病原菌，通过伤口或自然裂口侵入组织，并借助雨水飞溅或昆虫传播蔓延[1]；也有研究认为天麻软腐病由多种病菌引起，以孢囊孢子和菌丝体附着于块茎或菌材，随风传播侵害[5]。分离获得天麻软腐病相关细菌，是进一步防控研究的前提和基础。因此通过分离培养天麻健康块茎与患软腐病组织内的细菌，比较并研究二者之间细菌的种群和数量，为进一步确认和防控天麻软腐病原菌奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

样品为人工种植天麻，采集自云南省昆明市禄劝县。选取不同软腐程度的块茎，以健康块茎为对照，样品性状及取材部位见表1。

表1 天麻样品性状Tab.1 Characteristics of Gastrodia elata samples

1.2 分离纯化

1.2.1 培养基

TSA培养基：胰蛋白胨17.0 g、大豆胨3.0 g、葡萄糖2.5 g、NaCl 5.0 g、K2HPO42.5 g、琼脂18 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.0~7.4。

1.2.2 分离、培养与纯化

于超净工作台内用75%酒精对天麻进行表面消毒，用灭菌手术刀横切，按表1各组样品随机取材3块~5块，共5 g；放于装有无菌玻璃珠的45 mL 0.85%NaCl溶液中，28℃摇床震荡培养30 min；在超净工作台进行稀释，使质量浓度梯度为10-2g·mL-1~10-6g·mL-1；分别吸取质量浓度为10-4g·mL-1、10-5g·mL-1、10-6g·mL-1菌液100μL，均匀涂布于TSA培养基（每种质量浓度3个重复），于25℃培养箱中培养48 h；对上述平板进行单菌落计数，同时挑取平板上不同形态的菌落划线纯化；挑取纯化得到的单菌落接种至装有TSA液体培养基的离心管中进行培养，用于DNA的提取。

1.3 分子鉴定

1.3.1 DNA提取

培养液于5 000 r·min-1离心10 min，弃上清液；加入TES buffer（20 mmol·L-1Tris，50 mmol·L-1EDTA，150 mmol·L-1NaCl，pH 7.9），再于离心机中以13 000 r·min-1离心2 min，弃上清液；加入1.2 mL TES buffer重悬；加入300μL溶菌酶（5 mg·mL-1），37℃裂解细胞60 min。

1.3.2 PCR扩增

扩增正向引物为63f：5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′；反向引物为1495r：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR体系共25μL：DNA 1μL，正向、反向引物（5μmol·L-1）各1μL，10×buffer（Mg2+free）2μL，dNTPs（10μmol·L-1）1μL，BSA（1%）0.5μL，MgCl2（25 mmol·L-1）1.5μL，5 U·μL-1Taq酶0.3μL，ddH2O 16.7μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃延伸10 min。

1.4 测序分析

PCR反应试剂，Fermentas公司；Taq聚合酶，Takara公司；引物63f、1495r，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成；16S rDNA测序，由昆明硕擎生物科技有限公司完成。

使用BLAST对获得的序列与GenBank中的序列进行比对，相似度大于98%的作为一个运算分类单元OTU（operational taxonomic unit）。

2 结果与分析

2.1 细菌定量分析

对不同天麻块茎内分离得到的细菌菌落数进行统计，结果见表2。

由表2可知，天麻块茎组织内细菌菌落数量为2.0×104个/g～2.2×107个/g。样品中可培养细菌菌落数由高到低为：GE5＞GE4=GE1＞GE3＞GE2＞CK。对照样品（CK）内的细菌菌落数量远低于其他病变样品（GE2～GE5）内的细菌菌落数量；GE3和GE5分别取材于同一患病块茎中的未腐烂部分和腐烂部分，但二者菌落数目差异较大，腐烂部分的菌落总数远远大于未腐烂部分；说明细菌数量的增加与软腐病存在着较高的相关性。外表受损但内部完好的样品（GE1）组织内菌落数量远高于外表、内部均完好无损的样品（CK）组织内菌落数量，且仅次于外表破损、腐烂程度最高的样品（GE5）组织内菌落数量，说明外表破损导致了组织内细菌数量大量增加。

2.2 细菌多样性、组成及其分布

从天麻块茎组织中共分离出可培养细菌182株，经测序隶属于变形菌门（Proteobacteria）γ-变形菌纲（γ-Proteobacteria）的8属11种，包括浅黄色假单胞菌（Pseudomonas lurida）和帕勒隆尼氏假单胞菌（Ps.palleroniana）、拉恩氏菌（Rahnellasp.）、戴氏西地西菌（Cedecea davisae）、解鸟氨酸拉乌尔菌（Raoultella omithinolytica）、变栖克雷伯菌（Klebsiella variicola）和同属的克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）、路德维希肠杆菌（Enterobacter ludwigii）和同属的Enterobactersp.、泛菌（Pantoeasp.）和塔斯曼尼亚欧文氏菌（Erwinia tasmaniensis）。对182个菌株在8个属中的分布情况进行统计分析，结果详见图1。

图1 天麻组织内可培养细菌属的组成Fig.1 Genus of cultural bacteria in tissue of Gastrodia elata

由图1可知，8个属中假单胞菌属（Pseudomonas）为优势属，占细菌总数的60%；其中浅黄色假单胞菌为该属中的主要种类，占该属细菌总数的71%。欧文氏杆菌属（Erwinia）、西地西菌属（Cedecea）、肠杆菌属（Enterobacter）、克雷白氏杆菌属（Klebsiella）、泛菌属（Pantoea）、拉恩氏菌属（Rahnella）、拉乌尔菌属（Raoultella）分别占细菌总数的13.82%、7.42%、5.73%、4.93%、4.11%、2.6%、1.39%。

对分离出的可培养细菌在不同样品中的分布情况进行统计分析，结果见图2。

由图2可知，样品中可培养细菌的多样性由高到低为：GE5=GE4＞GE3＞GE1＞GE2＞CK。天麻的软腐组织（GE4、GE5）内具有最高的细菌多样性和一致的类群组成，均分离到8属11种细菌，与患病早期（GE2）及仅有破损（GE1）的天麻样品组织相比，增加了欧文氏杆菌属、肠杆菌属和拉恩氏菌属3个类群。完好块茎（CK）组织内分离到的细菌种类最少，只有浅黄色假单胞菌。假单胞菌属是所有样品中的主要细菌类群，可能在天麻发育和内源性细菌软腐病中发挥着重要作用。与完好的样品（CK）相比，外部受损但内部完好的样品（GE1）组织中增加了西地西菌属、克雷白氏杆菌属、泛菌属和拉乌尔菌属4个类群，这表明外表破损导致了组织内细菌多样性的显著增加；而与外表无破损的发病初期样品（GE2）相比，二者共同的类群包括假单胞菌属、西地西菌属、克雷白氏杆菌属和泛菌属，表明这些类群应该为内源性细菌，与天麻软腐病直接相关。拉乌尔菌属出现在仅外部受损的完好组织（GE1）、无破损的软腐组织（GE4）和外部受损的软腐组织（GE5）中，该类群为外源细菌的概率更高，极可能也与天麻细菌软腐病有关。

图2 不同天麻组织中可培养细菌的分布Fig.2 Distribution of cultural bacteria in different tissues of Gastrodia elata

2.3 天麻软腐病相关细菌分析

以上结果与统计分析显示，与健康天麻组织相比，患软腐病天麻组织内具有较高的细菌多样性和菌落数量，且随着腐烂程度的加重呈上升趋势，这表明细菌种类和数量的增加与软腐病存在着较高的相关性；假单胞菌属、西地西菌属、克雷白氏杆菌属和泛菌属应该为天麻内源性细菌，可能与其软腐病直接相关。综合分离得到的欧文氏杆菌属细菌分布情况（占细菌总数的13.82%）以及与其相关的大量植物软腐致病研究报道[6-9]，推测天麻软腐病的发生也与其密切相关。与外表完好的健康天麻组织相比，外表有破损的组织（包括内部健康和内部软腐的样品）内细菌多样性和数量均显著增加；可知外表破损是软腐病的诱因之一，拉乌尔菌属可能是外源性病原菌之一。

3 讨论

隶属于假单胞菌属的许多种类为根际促生菌[10]，也有部分种类是导致植物发生软腐病的病原菌，通过操控蛋白和植物毒素对寄主的保护机制进行破坏；如青枯假单胞杆菌（Ps.solanacarum）可导致姜软腐病[11]，边缘假单胞菌（Ps.marginalis）可导致马蹄莲软腐病[12]，Ps.grimontii为蝴蝶兰软腐病病原菌[13]。有的种类会因为宿主植物或环境的不同，由促生菌变为病原菌；如荧光假单胞菌（Ps.fluorescens）是蚕豆的促生菌[14]，但会导致大蒜心腐病[15]。此次研究结果表明，假单胞菌属可能在天麻发育和内源性细菌软腐病中发挥着重要作用。

欧文氏菌属一般被认为是植物软腐病的重要病原菌，通过产生果胶酶使组织的薄壁细胞浸离降解，进而导致软腐[16]。海芋欧文氏菌（Er.aroideae）和胡萝卜欧文氏菌（Er.carotovora）被认为是天麻软腐病的病原菌[17-18]。成团泛菌（Pa.agglomerans）被报道可引起稻谷内颖发生褐变、洋葱腐烂病、棉花细菌性烂铃病、日本鸡血藤和锥花霞草肿瘤病及香蕉叶鞘腐败病等[19]。Jain等[20]对全球兰科植物病害地理分布、致病因子等因素进行分析，发现泛菌属和欧文菌属细菌会导致兰科植物软腐病。而乌氨酸拉乌尔菌（R.ornithinolytica）能够降解木质纤维素，可致烟苗软腐[21]。综上分析，欧文氏菌属、泛菌属、拉乌尔菌属都可能是天麻软腐病的病原菌类群。

拉恩氏菌（Rahnellasp.）被报道与蜜环菌共同培养可以产生吲哚乙酸，促进天麻生长，增加天麻产量和提升块茎尺寸[22]。肠杆菌（En.ludwigii）和Enterobactersp.则被认为是根际促生菌，可以提高小麦的抗旱能力以及盐胁迫下小麦幼苗的生长[23-24]。此外，克雷白氏杆菌（Klebsiellsp.）可被制成生防剂，用于促进植物的生长[23，25-26]。综上分析，拉恩氏菌、肠杆菌和克雷白氏杆菌是否为天麻软腐病的病原菌需要进一步的验证。

此外，多种真菌比如钩状木霉菌（Trichoderma hamatum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、腐皮镰刀菌（F.solani）、强壮土赤壳（Ilyonectria robusta）也会导致天麻软腐病，且真菌侵染可能与栽培环境高温、高湿、透气不良有关[1,27-29]。实际生产中因为环境不适、连作障碍、虫害和采挖破损等因素，某些细菌和真菌类群分别或联合导致了软腐病的发生，其中细菌可能是内源性软腐病的主要致病类群。此次研究仅对可培养的细菌进行了初步分析，未涉及真菌和其他不可培养的微生物，而发病过程中核心微生物组、微生物群落演替及其与天麻的相互作用等研究需要进一步开展。