结肠癌中铁死亡相关蛋白GPX4的表达及其与预后的相关性

蓝炜强，陈光文，杨依昂，周香圆，吴海波，章毓厅，孙紫洋，2,3，金 玉，2,4，朴俊杰，2,3

铁死亡(ferroptosis)是近年来新发现的，区别于细胞凋亡和细胞自噬的一种程序性死亡方式[1]。细胞铁死亡过程伴随着大量铁离子的累积和脂质过氧化[2]。近年来，越来越多的研究证实铁死亡相关蛋白在肿瘤的发生、发展中起重要作用，被认为可预测多种肿瘤的预后，如FTH1[3]、NCOA4[4]、SLC7A11[5]、HMOX1[6]等。GPX4属于磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)，是铁死亡的关键蛋白之一[7]。GPX4蛋白在细胞中具有清除脂质过氧化物的作用，GPX4失活可导致氧化平衡被打破，脂质过氧化物破坏膜结构，从而激发铁死亡[8]。有研究[9]显示GPX4与肿瘤的发生、发展密切相关，在乳腺癌[10]、淋巴瘤[11]、肝癌[12]等肿瘤中GPX4蛋白表达高于正常组织。目前尚未见GPX4表达与结肠癌患者预后关系的研究报道。本文采用免疫组化SP法检测GPX4在结肠癌及癌旁正常组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系，探讨GPX4蛋白及GPX4和GNL3蛋白的联合作用在结肠癌患者预后中的临床价值。

1 材料与方法

1.1 临床材料人类结肠癌组织芯片购自上海芯超生物公司。该芯片有149个位点，包括82例原发结肠癌标本和67例癌旁标本。82例结肠癌中，男性40例，女性42例；患者年龄27～90岁，其中年龄<60岁25例，≥60岁57例；依据国际AJCC分期标准：Ⅰ+Ⅱ期51例，Ⅲ+Ⅳ期31例；有淋巴结转移者30例，无淋巴结转移者52例；有远处转移者4例，无远处转移者78例。82例结肠癌患者手术时间为2007年6月至2008年4月，并对所有患者进行随访，每3个月进行电话随访1次，随访截至2015年7月。

1.2 总RNA提取和qRT-PCR实验8例新鲜结肠癌和癌旁正常组织由延边大学医学院肿瘤组织库提供。组织样品置于研钵磨中磨碎，利用TRIzol等试剂提取组织中的总RNA。采用PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒反转录为cDNA。以β-actin为内参，利用SYBR qPCR Master Mix试剂盒检测GPX4基因表达情况。GPX4引物序列如下GPX4-F：5′-GAGGCAAGACCGAAGTAAACTAC-3′；GPX4-R：5′-CCGAACTGGTTACACGGGAA-3′。反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s(合计40个循环)，利用2-ΔΔCt法计算各样本mRNA的相对表达量。

1.3 免疫组化免疫组化染色采用SP法。组织芯片60 ℃烤箱脱蜡，常温烘干，二甲苯脱蜡，PBS洗3次；应用柠檬酸盐高温修复抗原，BSA封闭，PBS洗3次；3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶的活性；加入一抗GPX4(稀释比1∶100，Proteintech，美国)4 ℃孵育过夜；加入二抗(北京中杉金桥公司)37 ℃孵育20 min，PBS洗3次；滴加DAB显色剂，苏木精复染，脱水、透明、封固。

1.4 结果判定邀请3位病理学专家分别评估结肠癌组织中GPX4蛋白表达水平：(1)以细胞质中出现褐色颗粒视为GPX4蛋白阳性；(2)根据阳性染色强度按未着色、淡褐色、褐色、棕褐色分成4个等级，分别判为0、1、2、3分；(3)将阳性面积占比按≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分成5个等级，分别判为0、1、2、3、4分。将两项评分相乘记为总评分：0～3分为阴性(-)，4～6分为弱阳性(+)，7～9分为阳性()，10～12分为强阳性()。

1.5 细胞培养结肠癌细胞SW620由延边大学肿瘤研究中心组织库提供。SW620细胞常规培养于含10%胎牛血清、10 μg/mL链霉素和100 μg/mL青霉素的DMEM培养液，于5%CO2、37 ℃细胞培养箱中培养，隔2天换液，34天传代。

1.6 Western blot法应用Western blot实验检测SW620细胞敲低GNL3后GPX4和GNL3蛋白的表达。RIPA裂解液裂解细胞，BCA法测定蛋白浓度。变性，上样，SDS-PAGE凝胶电泳分离，转膜。5%牛奶封闭2 h，一抗孵育过夜。TBST洗膜，二抗孵育1 h。加入ECL化学发光液，凝胶成像仪曝光。

1.7 慢性毒转染将SW620细胞按1×105个/孔接种到24孔板，过夜。第2天，用2 mL含6 mg/L polybrene的新鲜培养液替换原培养基，并加入适量慢病毒悬液。培养24 h后，用新鲜培养基替换，继续培养72 h后，进行沉默效率的验证。

1.8 统计学方法采用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析，采用χ2检验计算分类变量的组间差异，运用Kaplan-Meier法和Cox回归模型进行生存分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织中GPX4 mRNA的表达GEO数据库(GSE74604)分析结果显示：结肠癌组织中GPX4 mRNA表达水平高于癌旁组织(图1A)。qRT-PCR检测8例结肠癌组织及癌旁组织中GPX4 mRNA的表达，结果显示结肠癌组织中GPX4 mRNA表达普遍高于癌旁组织(图1B)。

图1 结肠癌及癌旁组织中GPX4 mRNA的表达：A.GEO数据库分析结肠癌组织中GPX4 mRNA的表达；B.qRT-PCR检测结肠癌及癌旁组织中GPX4 mRNA的表达

2.2 结肠癌组织中GPX4蛋白的表达免疫组化结果显示GPX4蛋白在结肠癌组织中主要定位于细胞质(图2)。GPX4蛋白在结肠癌组织中的阳性率和强阳性率分别为91.5%(75/82)和43.9%(36/82)；在癌旁组织中的阳性率和强阳性率分别为32.8%(22/67)和3.0%(2/67)，差异均有统计学意义(P<0.01，图2，表1)。以上结果说明，GPX4蛋白在结肠癌组织中的表达高于癌旁组织。

图2 结肠癌及癌旁组织中GPX4蛋白的表达，SP法：A.GPX4蛋白在癌旁组织中呈阴性；B.GPX4蛋白在结肠癌组织中呈弱阳性；C.GPX4蛋白在结肠癌组织中呈阳性；D.GPX4蛋白在结肠癌组织中呈强阳性

表1 不同结肠组织中GPX4蛋白的表达

2.3 结肠癌中GPX4蛋白表达与临床病理特征的关系结肠癌组织中GPX4蛋白表达与患者性别、年龄、病理分级、AJCC分期、淋巴结转移、远处转移(χ2=0.610，P=0.627)均无相关性(P>0.05)。GPX4蛋白在肿瘤直径≤6 cm和>6 cm结肠癌组织中的强阳性率分别为55.3%和31.0%，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 结肠癌中GPX4蛋白表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.4 GPX4蛋白表达与结肠癌患者生存率的关系Kaplan-Meier生存分析显示：GPX4蛋白强阳性结肠癌患者的总生存率显著低于GPX4蛋白非强阳性患者(P=0.03，图3)。为进一步探寻GPX4蛋白表达对结肠癌患者预后的影响，分别将结肠癌浸润深度、病理分级、远处转移情况分成亚组进行生存分析，结果显示在浸润深度T1～3、病理分级Ⅱ～Ⅳ、无远处转移亚组中GPX4蛋白强阳性者预后较非强阳性者差，差异有统计学意义(P<0.05，图3)。

图3 结肠癌中GPX4蛋白表达与患者生存率的关系：A.GPX4表达与结肠癌患者总生存率之间的关系；B.浸润深度pT1～3结肠癌中GPX4表达与患者生存率的关系；C.病理分级Ⅱ～Ⅳ结肠癌中GPX4表达与患者生存率的关系；D.无远处转移结肠癌中GPX4表达与患者生存率的关系

单因素Cox回归分析显示：GPX4蛋白强阳性(P=0.035)、浸润深度T4(P=0.001)、淋巴结转移(P=0.001)、远处转移(P=0.002)、AJCC分期Ⅲ+Ⅳ期(P<0.001)是影响结肠癌患者预后的危险因素(表3)。将上述有统计学意义的因素进行多因素Cox回归分析，结果显示GPX4蛋白强阳性(P=0.019)和浸润深度T4(P=0.035)是结肠癌患者预后的独立影响因素(表3)。

表3 单因素和多因素Cox回归分析结肠癌患者预后的风险因素

2.5 联合评估GPX4与GNL3蛋白表达对结肠癌患者预后的预测作用χ2检验结果显示结肠癌组织中GPX4蛋白表达与GNL3蛋白表达呈正相关(χ2=4.367，P=0.037，表4)。Western blot实验结果显示：在SW620细胞中敲低GNL3表达可诱导GPX4蛋白表达减少(图4)。Kaplan-Meier生存分析结果显示：GPX4和GNL3均强阳性患者的生存率低于GPX4强阳性、GNL3非强阳性患者(P=0.007，图5)。

图4 Western blot法检测敲低GNL3后GPX4蛋白表达的改变

图5 GPX4和GNL3表达水平与结肠癌患者生存率的关系

表4 结肠癌组织中GPX4与GNL3蛋白表达的相关性

3 讨论

结直肠癌是全球常见的恶性肿瘤，其发病率及病死率与日俱增[13]。结直肠癌常用的治疗方式为手术治疗，术后辅以放、化疗，然而疾病治疗的前提是早期准确诊断[14]。结肠癌的肿瘤标志物在结肠癌的诊断中具有重要意义。肿瘤标志物是在肿瘤细胞或细胞膜表面，或机体对肿瘤的免疫反应产生，分泌或释放到人体体液或组织中的物质[15]。肿瘤标志物在肿瘤患者的早期诊断、制定治疗计划、预后评估、复发监测等方面具有重要的参考价值[16]。因此，寻找有效的肿瘤标志物是提高结肠癌患者生存率的重要途径。

GPX4是GPX的亚型之一，相比其他亚型，GPX4的作用是将脂质氢过氧化物还原为无毒脂质醇，从而限制了脂质过氧化物在细胞膜内的传播，具有特异性催化细胞膜脂质过氧化物降解的能力[17-18]。有研究表明，GPX4在肿瘤的发生、发展中起重要作用，如Peng等[19]发现GPX4通过调控活性氧(reactive oxygen species, ROS)影响肿瘤上皮-间质转化过程。此外，GPX4还可以通过介导非小细胞肺癌的铁死亡过程来降低其对放疗的耐药[20]。除了通过调节铁死亡，GPX4还可以通过维持肿瘤干细胞特性，进而促进肺腺癌及胰腺癌的增殖和转移能力[18-19]。说明GPX4在多种恶性肿瘤的发生发展、侵袭转移等过程中发挥着关键作用。

本实验采用免疫组化法检测82例结肠癌组织和67例癌旁组织中GPX4蛋白表达，结果发现GPX4蛋白在结肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织，且其表达与结肠癌肿瘤直径密切相关，这一发现与最近其它研究结果一致。例如，王首寒等[21]发现，与正常胃组织相比，胃癌组织中GPX4表达增加；Zhao等[22]同样发现GPX4蛋白在胶质瘤中异常高表达。Kinowaki等[11]报道GPX4过表达可抑制ROS介导的肿瘤细胞死亡。众所周知，肿瘤细胞因其代谢活跃，产生大量的代谢产物及氧化物，而GPX4高表达有利于肿瘤细胞应对氧化应激，使得癌细胞增殖能力增强，抵抗凋亡，进而促进疾病的发展。生存分析结果显示，GPX4蛋白强阳性患者的生存率与GPX4蛋白非强阳性患者相比明显降低，提示GPX4蛋白高表达与结肠癌患者预后不良有关。另外，有学者发现GPX4能够与mTOR信号通路相互作用[23]，然而该通路是否在结肠癌中发挥调控作用有待进一步探究。

GNL3是一种多功能蛋白，在细胞自我更新、细胞增殖、凋亡、维持细胞基因组稳定性和端粒完整性等多种细胞生物学功能中发挥重要作用。本实验发现GPX4蛋白表达水平受GNL3蛋白的调控，说明GPX4、GNL3蛋白在结肠癌中共同作用参与调控肿瘤的发生、发展。另外，结肠癌组织中GPX4表达异常增高可能与GNL3蛋白的异常表达有关。然而，GNL3通过何种途径调控GPX4蛋白表达，以及两者在结肠癌中的具体作用机制有待进一步探究。

综上，GPX4高表达与结肠癌的发生发展及不良预后密切相关，GPX4可作为结肠癌潜在的分子标志物以及预后评估指标。然而，GPX4在结肠癌中的分子机制尚未明确，有待进一步深入探究。