三阴型乳腺癌中Galectin-9和FGL1的表达及意义

蔡小波，王小佩，曹学全，杨朝晖

乳腺癌是影响女性健康的常见疾病[1]，随着乳腺癌诊疗水平的提高，患者生存期明显提高，但一些特殊类型亚型如三阴型乳腺癌(triple-negtive breast cancer, TNBC)，预后不佳[2]。肿瘤免疫治疗已成为恶性肿瘤治疗的重要手段之一[3]。PD-1药物在TNBC治疗中展现了积极的治疗效果[4-5]。但PD-1/PD-L1在TNBC患者中的阳性率低，约20%[6]。因此，探索新的免疫逃逸通路及调控路径，有望增强免疫治疗在TNBC治疗中的效果。

研究发现，FGL1/LAG-3是另一条肿瘤免疫逃逸通路[7]，阻断该通路可刺激肿瘤微环境中T细胞的活化和增殖来提高机体对肿瘤的免疫与清除。Galectin-9/Tim-3通路能增加效应性T细胞的抗肿瘤免疫功能[8]。然而，上述通路在TNBC中的研究报道较少，因此，检测TNBC中Galectin-9和FGL1的表达情况，有助于为TNBC的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 一般资料选取2016年1月～2019年12月台州市中心医院(台州学院附属医院)行手术治疗的108例TNBC患者，同时选取108例非TNBC患者作为对照。以上患者临床资料均完整，符合入组标准。

1.2 方法通过生物信息学数据库TIMER检索Galectin-9、FGL1在乳腺癌中的表达及免疫浸润状态。收集上述标本，提取组织总RNA，经逆转录后荧光定量PCR检测Galectin-9、FGL1的mRNA表达水平。免疫组化染色采用EnVision法，经BENCHMARK平台(Roche公司)检测Galectin-9和FGL1的蛋白表达水平。抗体Galectin-9购自Cell Signaling Technology公司，FGL1购自Abcam公司，二抗及显色试剂购自Roche公司。Galectin-9和FGL1阳性结果判读参照文献[9-10]。免疫组化结果经两位病理医师独立阅片和诊断，综合判定结果。收集上述患者的临床资料，分析Galectin-9、FGL1表达水平与临床病理特征的相关性。

1.3 观察指标(1)观察Galectin-9、FGL1在免疫浸润中的调节模式；(2)对比各组Galectin-9、FGL1 mRNA和蛋白的表达差异情况；(3)观察Galectin-9、FGL1蛋白表达与临床病理特征的相关性。

1.4 统计学分析所有数据采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学分析TCGA数据库检索结果显示，Galectin-9(图1A)和FGL1(图1B)在乳腺癌中均呈高表达。Galectin-9表达与B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞呈正相关，FGL1表达与B细胞、CD4+T细胞、树突状细胞呈负相关，与CD8+T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞呈正相关(图2)。

图1 TCGA数据库分析乳腺癌中Galectin-9(A)和FGL1(B)的表达水平

图2 乳腺癌中Galectin-9(A)和FGL1(B)的免疫浸润水平

2.2 TNBC组织和非TNBC组织中Galectin-9、FGL1的表达TNBC组中Galectin-9、FGL1 mRNA阳性率分别为55.55%和26.85%，与正常组织相比差异有统计学意义(P<0.05)，非TNBC组中Galectin-9、FGL1 mRNA阳性率分别为47.22%和12.96%，与正常组织相比差异有统计学意义(P<0.05)。

TNBC组Galectin-9在肿瘤细胞和间质肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)中的阳性率分别为50.93%、52.78%；FGL1在肿瘤细胞和间质TIL中的阳性率分别为27.78%、30.56%。非TNBC组Galectin-9在肿瘤细胞和间质TIL中的阳性率分别为39.81%、38.89%，FGL1在肿瘤细胞和间质TIL中的阳性率分别为14.81%、13.89%。TNBC组相对非TNBC组Galectin-9、FGL1表达水平更高(表1，图3)。

图3 A.Galectin-9在正常乳腺组织中的表达，EnVision法；B.Galectin-9在TNBC中的表达，EnVision法；C.Galectin-9在非TNBC中的表达，EnVision法；D.FGL1在正常乳腺组织中的表达，EnVision法；E.FGL1在TNBC中的表达，EnVision法；F.FGL1在非TNBC中的表达，EnVision法

表1 TNBC组织和非TNBC组织中Galectin-9、FGL1蛋白的表达[n(%)]

相关性分析结果显示，TNBC肿瘤细胞和间质TIL中Galectin-9表达与患者年龄、肿瘤直径和肿瘤分化程度无关(P>0.05)，与组织学分级和淋巴结转移相关(P<0.05)；TNBC肿瘤细胞和间质TIL中FGL1表达与患者年龄和肿瘤分化程度无关(P>0.05)，与肿瘤直径、组织学分级、淋巴结转移相关(P<0.05，表2)。

表2 TNBC中Galectin-9及FGL1在肿瘤细胞和间质TIL中的表达及与临床病理特征的关系

在组织学类型中，统计标本有浸润性导管癌、浸润性小叶癌和浸润性微乳头癌三种类型，在非TNBC组中，Galectin-9和FGL1表达与组织学类型无关(P>0.05)，且各组间相比差异无统计学意义(P>0.05，表3)。Galectin-9和FGL1在TNBC浸润性导管癌和非TNBC浸润性导管癌中的表达差异有统计学意义(P<0.05)，而在浸润性小叶癌和浸润性微乳头癌中差异无统计学意义(P>0.05，表4)。

表3 Galectin-9及FGL1在非TNBC不同组织学类型中的表达

表4 Galectin-9及FGL1在TNBC和非TNBC不同组织学类型中的表达

3 讨论

乳腺癌中TNBC占乳腺癌肿瘤的10%～20%，因其缺乏明确的靶向治疗位点，进而影响患者的生存期[11]。随着乳腺癌精准治疗和分子分型的研究推进，目前认为TNBC可以分为4个亚型，分别为免疫调节型(mmunomodulatory, IM)、腔面雄激素受体型(luminal androgen receptor, LAR)、基底样免疫抑制型(basal-like immune-suppressed, BLIS)和间质型(mesenchymal, MES)，其中IM亚型间质TIL显著增多，具有高免疫原性特性，具有肿瘤免疫治疗的应用前景，并且能够对肿瘤免疫有效应答[12]。

肿瘤免疫治疗是TNBC的一个突破口，近年来，通过阻断PD-1/PD-L1通路来调节机体免疫状态，抑制免疫逃逸的“免疫正常化”[13]治疗策略，已经成功的在非小细胞肺癌、黑色素瘤、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤等疾病中开展临床治疗。针对TNBC的PD-1/PD-L1研究和联合治疗等策略[14]，已经有多项策略在临床试验中开展，并获得积极进展。PD-1/PD-L1在TNBC中存在阳性率低，部分阳性患者应答效率低等问题，因此针对阴性患者寻找新的免疫抑制逃逸通路和对于应答效率低的阳性患者寻找具有协同作用的免疫通路，值得进一步研究。

Tim-3是一类T细胞表面抑制性分子，能够引起T细胞衰竭，其中一个配体为Galectin-9[15]。Tim-3在肿瘤T细胞的损耗中起关键作用。协同抑制PD-1/PD-L1和Tim-3/Galectin-9通路能够较好的纠正T细胞的耗竭状态，并能够增加效应性T细胞的抗肿瘤免疫功能，且Tim-3与抗PD-1治疗的药物耐药紧密相关[16]，提示Galectin-9可以作为和PD-L1的有效协同靶点。FGL1/LAG-3是目前新发现的另一条肿瘤免疫逃逸通路[17]，阻断该通路能够刺激肿瘤微环境中T细胞的活化和增殖[18]。LAG-3是一个在活化T细胞上发现的跨膜蛋白[19]。LAG-3主要功能为作为受体传递抑制性信号[20]。FGL1是LAG3的一个功能性配体。FGL1表达上调与肿瘤的进展及预后不佳相关，在胃癌[21]和肝癌[22]中均见相关报道。上述研究结果表明，FGL1在肿瘤的发生、进展中起重要作用。进一步研究发现，FGL1/LAG-3相互作用是独立于PD-1/PD-L1通路的另一条肿瘤免疫逃逸通路。FGL1/LAG-3有望成为TNBC中继PD-1/PD-L1后的另一个治疗靶点。

目前临床研究主要集中于FGL1和Galectin-9的受体LAG-3和Tim-3，当前针对LAG-3和Tim-3靶点的药物尚未上市，但相应涉及黑色素瘤、血液肿瘤和实体瘤等临床研究，分别有临床Ⅰ～Ⅲ期不同阶段的研究开展。BMS公司[23]和默沙东公司[24-25]的LAG-3抗体在各种实体瘤中开展临床研究，有部分已经展示了治疗潜力。Tim-3抗体目前已在肺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌等多项实体瘤中展开研究，Cobolimab为全球开发阶段最高的Tim-3抗体，与PD-1抗体联用可明显抑制肿瘤发展[26]。相比于PD-1/PD-L1，以LAG-3和Tim-3为靶点的药物开发尚属早期，但均展现了客观的治疗效果，因此其受体在肿瘤中表达情况的研究，尤其是在TNBC等报道较少领域的研究，有助于推进FGL1/LAG-3和Galectin-9/Tim-3靶点药物的研究。

本实验中，Galectin-9和FGL1在TNBC中显著高表达，其mRNA和蛋白水平阳性率分别为55.55%、50.93%和26.85%、27.78%，在间质TIL中同样具有相同趋势的表达[27]。与临床病理相关指标研究表明，其与组织学分级、淋巴结转移等存在相关性，提示Galectin-9和FGL1可能是TNBC的有效靶点之一。经TIMER数据库[28]检索肿瘤组织中的6种免疫细胞的浸润情况[29]表明，Galectin-9与FGL1的免疫浸润模式存在不同，这或许与Galectin-9和FGL1与PD-L1的表达模式不同存在相关性，值得后续进一步探究。而在组织学类型中，Galectin-9和FGL1在TNBC和非TNBC浸润性导管癌中的表达差异有统计学意义，在浸润性小叶癌和浸润性微乳头癌中的表达差异无统计学意义。但由于浸润性小叶癌和浸润性微乳头癌病例数限制，还有待进一步研究。

综上，在分子及蛋白表达水平上，TNBC组与非TNBC组均高表达Galectin-9与FGL1，提示针对TNBC的治疗具有潜在的前景，有可能在TNBC的免疫治疗中产生积极的效果，相关后续研究深入探究其相互作用，并深入分析各TNBC亚型中Galectin-9与FGL1的表达情况，有望对TNBC患者的免疫治疗产生积极作用。