量子点在兽医领域应用研究进展

李任峰，秦保亮，金前跃，王自良*

(1.河南科技学院动物科技学院，河南新乡 453003；2.新乡市动物疫病预防控制中心，河南新乡 453003；3.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南郑州 450002)

量子点(quantum dots，QDs)是一种半径小于或接近于激子玻尔半径的新型纳米材料，由少量的原子组成，外观一般呈球形或类球形，又被称为纳米晶[1]，传统的量子点材料由Ⅱ-Ⅵ族、Ⅲ-Ⅴ族或Ⅳ-Ⅵ族元素组成，研究较多的主要是CdX(X=S、Se、Te)[2]。目前，量子点的概念已经从最初的半导体纳米晶延伸到碳量子点、二维量子点以及钙钛矿量子点等。对于量子点的研究最早开始于20世纪80年代，早期主要集中在物理、电子和材料工程领域。1998年美国加州伯克利大学的Alivisatos研究团队和印地安纳大学Nie研究小组同时在《Science》杂志发文，提出将量子点用于生物标记材料，开创了量子点在生命科学领域研究的先河[3-4]。本文围绕量子点的特性、种类及其在兽医领域的应用研究展开综述，为拓展对量子点的认识以及将来更好地将其应用于兽医领域提供参考。

1 量子点的特性

量子点具有一系列独特而优良的光学特性，包括：①量子点比有机荧光分子稳定，不易发生光漂白；②荧光吸收谱宽，单光子和双光子均可吸收；③发射谱窄(通常半峰宽低于40 nm)而对称，无长波段拖尾现象；④荧光强度大，量子产率高(>20%)，生物相容性好；⑤具有独特的量子效应和较大的斯托克斯位移；⑥与普通有机染料相比，量子点荧光寿命较长(20 ns～40 ns)，有利于提高检测结果的对比度和准确性[2,5]。另外，量子点在外界能量激发的情况下，可发出与其自身能级相对应的荧光，用一种激发光源可以同时激发不同粒径和组成的量子点。因此，通过合成不同粒径大小或组分的量子点可获得从蓝色到红色不同波长的荧光，几乎可以覆盖整个可见光范围，有利于实现对多组分目标分子的实时检测[6]。

2 量子点的种类

量子点的种类包括半导体量子点、碳量子点、二维量子点和钙钛矿量子点等。其中，半导体量子点根据组成元素不同又可分为Ⅱ-Ⅵ族(包括CdS、CdSe、CdTe、ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe等)、Ⅲ-Ⅴ族(包括InN、InP、InAs、InSb、GaN、GaP、GaAs、GaSb等)、Ⅳ-Ⅵ族(包括PbS、PbSe、PbTe等)以及Ⅳ族(Si)。比较成熟的材料是以CdSe为核心的核壳类量子点，具有发光半峰宽窄(FWHM<30 nm)、量子产率高(>90%)、蓝光吸收好、稳定性强等特点[7-8]。

碳量子点(C-QDs)是一类由准离散球形碳纳米颗粒组成的纳米材料，大小在10 nm以下。作为一种新型量子点，C-QDs的发射光谱通常依赖于量子点大小和激发光的波长。传统半导体量子点由于其重金属含量高而毒性较强，限制了它们在纳米医学中的应用。C-QDs除了具备类似于传统量子点的发光性能和小尺寸特性外，还具有毒性小、成本低、生物相容性好、易修饰等优点，成为取代半导体量子点在纳米医疗领域中应用的又一新型材料[9-10]。

在更小的纳米尺度下，量子点能以二维晶格形式存在，即二维量子点。组成二维无机化合物家族的成员几乎涵盖了整个化学元素周期表，包括石墨烯、硅烯、锗烯、磷烯、氟石墨烯、氟硅烯、氟锗烷、石墨烷、硅烷、锗烷、氮化物(如h-BN、g-C3N4等)、碳化物(如碳化硅)、半金属硫系化合物、过渡金属卤化物，过渡金属氧化物、锰烯、黏土、氢氧化物、磷酸盐和三元化合物(如CuSbS2)等[11-12]。近年来，二维石墨烯材料已成为许多领域研究热点。当石墨烯薄层尺寸小于20 nm时即呈现出激发光。与大尺度石墨烯相比，纳米尺度石墨烯既保留了石墨烯固有的优点，又展现出一些新的特性，如具有较大的比表面积、溶解性好、易于组装和修饰等。石墨烯量子点为石墨烯的研究提供了新的思路，同时也为其他二维量子点的研究指明了方向[13]。

钙钛矿量子点是指一系列具有ABX3化学式的化合物所组成的新型发光材料。其中A为碱金属阳离子，B为二价金属阳离子，X为卤素阴离子。与其它材料相比，钙钛矿量子点具有以下优势：(1)发光效率高，量子产率可达90%；(2)制备成本低，可在常温溶液中完成；(3)波长可调、发射光谱窄。通过调控阴离子配比并结合高温热注入法，可使其发光波长覆盖整个可见光区域(450 nm～520 nm)。以上特点使得钙钛矿量子点特别适合应用于显示技术领域。目前，钙钛矿量子点已成为发光二极管、太阳能电池、光电探测器以及激光等领域的热门材料[14]。

3 量子点在兽医领域的应用

量子点作为一种新型荧光材料，具有激发光谱范围宽、发射谱窄、发光效率高、颜色可调等优点，目前已被广泛应用于细胞及组织成像、活体动物体内靶向示踪、药物筛选、生物分子(DNA、RNA、葡萄糖等)及病原体检测等多种生物分析中[6,11,15]。在兽医领域，量子点在动物病原体检测和病毒示踪方面得到越来越多的研究和应用。

3.1 量子点在病原检测方面的应用

在生物医学领域，研究人员利用量子点独特的光学和电学特性，通过与抗原、抗体或DNA等生物分子偶联作为标记物，建立了多种用于肿瘤和传染病诊断的生物分析技术[11]。作为新型荧光标记材料，量子点在兽医病原检测方面的应用也越来越受到重视。林彦星等根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)VP73蛋白的氨基酸序列推测抗原表位优势区域，合成表位多肽并与牛血清白蛋白偶联，筛选有抗原性的多肽作为试纸条检测线的包被抗原，采用量子点作为标记材料对葡萄球菌蛋白A(SPA)进行标记，以抗SPA的多克隆抗体作为质控线的包被蛋白，研制了能够快速检测ASFV抗体的量子点免疫层析试纸条，该试纸特异性强、敏感性高、稳定性好、操作简便，可用于ASFV抗体的快速检测和流行病学调查，为ASFV的防控提供了重要技术支撑[16]。为建立快速、简便检测猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)抗体的方法，江地科等将纯化的重组CSFV E2蛋白作为捕捉抗原，分别采用胶体金和量子点(CdSe)标记，将纯化的抗CSFV E2蛋白多克隆抗体和HRP兔抗猪IgG包被于硝酸纤维素膜上，分别作为质控线(C线)和检测线(T线)，研制了胶体金和量子点免疫层析试纸，两种试纸均具有较好的敏感性和特异性，且量子点试纸的阳性率和符合率均高于胶体金试纸，可用于CSFV的临床快速检测[17]。

刘旭辉等采用CdSe量子点标记鸡抗禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)抗体，并对标记的抗体量子点复合产物进行了纯化。用H5N1型AIV单克隆抗体作为包被抗体，以CdSe量子点标记的鸡抗AIV IgG作为检测抗体，建立了基于纳米量子点的AIV快速检测方法。该方法的敏感性比血凝试验高出4倍以上，具有较好的特异性和灵敏度，而且操作简单，检测快速，在AIV临床检测和进出口检疫方面具有很好的应用前景[18]。Wu等将量子点(CdSe/ZnS QDs)通过酰胺键与流感病毒(H5和H9亚型)的单克隆抗体偶联作为荧光探针，包被的抗H5和H9亚型流感病毒抗体分别作为检测线1和检测线2，包被的羊抗鼠 IgG作为控制线，建立了基于量子点标记抗体的免疫层析试纸，该试纸可同时检测H5和H9亚型流感病毒，检测限分别达到0.016 HAU和0.25 HAU。而且该方法操作简便，可在15 min内完成检测，具有很好的特异性和敏感性，为流感病毒的早期诊断和监测提供了新方法[19]。孙洁等采用荧光量子点标记H5亚型AIV单克隆抗体，建立了基于夹心法原理的免疫层析检测试纸条。该试纸能够特异性检测出H5N1、H5N2等H5亚型AIV，而与H1N1、H3N2、H7N9、H9N2、NDV等无交叉反应，最低检测量为1 ng/mL，比市售H5亚型AIV胶体金检测试纸条灵敏度高100倍，为H5亚型禽流感的流行病学调查和快速诊断提供了新的方法[20]。石墨烯氧化物和金纳米颗粒作为生物医学材料已被广泛应用于诊断、治疗和药物的输送等领域。Kim等采用原位还原法将石墨烯氧化物和金纳米颗粒制成纳米复合材料，通过与PCR试剂混合，建立了一种新的纳米PCR检测技术，可用于口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)的早期感染诊断，相较于传统PCR的检测限提高了1 000倍，对于FMD的防控具有重要的临床应用价值[21]。

3.2 量子点在病原示踪方面的应用

用量子点标记病毒颗粒，通过单病毒示踪 “可视化”技术研究病毒对宿主细胞的相互作用，有助于深入探索病毒的侵染机制。在兽医领域，量子点已成为病原示踪研究的热点材料。猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)是危害养猪业的一种重要病原。Lv等采用量子点标记PRV和病毒示踪技术研究了PRV的入侵机制，提出了PRV通过巨胞饮作用进入HeLa细胞的感染模型。PRV首先发生细胞吸附，然后沿着富含肌动蛋白的突起移动到质膜上，并被限制在质膜。随后，PRV被内化进入含有SNX5阳性巨胞饮体的HeLa细胞中。研究结果证明了巨胞饮是PRV进入HeLa细胞的主要途径，拓展了人们对于PRV的致病机制的认识，同时也为研制抗PRV药物提供了新的方向[22]。为了研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)的感染机制，Hou等采用无铜催化的点击化学反应对PEDV进行量子点标记，同时在培养基中添加1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[二苯并环辛基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG-DBCO)，病毒在Vero细胞增殖过程中，DSPE-PEG-DBCO吸附在病毒囊膜上，并进一步与量子点(QD-N3)结合，从而形成量子点标记病毒，通过单病毒粒子示踪研究了PEDV在Vero细胞中的感染动力学[23]，为阐明PEDV的致病机制提供了重要线索。最近，哈尔滨兽医研究所的研究人员将量子点与基因编辑技术相结合，通过将生物素化的dCas9、PRV特异性的gRNA和链霉亲和素修饰的量子点(SA-QDs)转染进入细胞，采用单病毒示踪技术系统研究了PRV在Vero细胞和HeLa细胞中入胞、膜融合、胞内运输、基因组入核等动态过程，研究结果为深入揭示PRV的致病机制提供了新的参考[24]。

4 展望

量子点在生命科学及医学中的应用前景十分广阔。当前，新冠肺炎疫情仍在全球肆虐，科研人员已开始将量子点应用于新冠肺炎的诊断、药物开发、致病机制等方面的研究[25-26]。在兽医领域，尽管量子点已经在动物病原检测及病原示踪方面得到逐步应用，但由于其合成及成核条件要求苛刻(需要在高温、绝氧、绝水等条件下成核)，同时存在稳定性差、易于聚集、表面难以修饰等不足，使得量子点在兽医领域的研究成果仍相对较少，更缺乏较为成熟的研究产品。未来仍需对量子点的合成与标记技术进行改进，寻求调控量子点尺寸、结构、性能和分散度的更好方法，降低标记成本，加强与新兴技术(如CRISPR/Cas9、微流控、生物传感器等)的结合，使其在动物疫病诊断、兽药研发以及病原体致病机制研究等方面发挥更大作用。相信量子点技术的发展和完善将会给兽医领域带来新的更多的发展契机。