动物Toll样受体8的免疫学功能研究进展

刘学良，敖 大，姜 森，李鑫帅，李树斌，夏能文，朱建中

(1.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009；3.农业与农产品安全国际联合研究实验室，江苏扬州 225009)

Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)是最早发现的天然免疫受体家族，能够识别广泛的病原相关分子模式。目前，在人和小鼠中发现的Toll样受体分别至少有10种和12种，TLR1-9为人和鼠共有，人TLR11-13的基因已经从人基因组中丢失，鼠TLR10由于反转录病毒的插入而失去功能[1]。TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR10在细胞表面表达，TLR3、TLR7、TLR8、TLR9定位于细胞内体，但也有一小部分TLR8在细胞表面表达[2]。在人类10个TLR中，感知核酸仅限于TLR3、TLR7、TLR8和TLR9，其中TLR7、TLR8、TLR9一起组成TLR7/8/9亚家族。TLR8是哺乳动物天然免疫中非常重要的模式识别受体，在促炎、抗病毒感染、抗细菌感染等方面发挥重要作用。但最初人们认为鼠TLR8没有活性，所以相比其他的TLR成员，TLR8的研究相对滞后，因此TLR8在动物医学研究和应用中还具有相当大的潜力。

1 TLR8研究历史与特点

Toll样蛋白可以影响果蝇幼虫背腹侧轴体的发育，随着对Toll样蛋白研究的深入，人们渐渐发现Toll样蛋白在成年果蝇中对抵抗真菌感染、产生有效免疫反应具有关键作用，这确立了果蝇Toll样蛋白的免疫学意义，之后人们把在哺乳动物中发现的果蝇Toll样蛋白的同源物称为Toll样受体[1]。20世纪初，人们在人类基因组数据库中搜索发现了3种新型人类Toll样受体(human Toll-like receptors，hTLR)，分别是hTLR7、hTLR8、hTLR9。hTLR 7-9包含具有多个富亮氨酸重复序列的膜外域和与人白介素1(interleukin-1，IL-1)受体同源的胞质域。在组织水平上对hTLR7-9的mRNA表达进行分析，发现与其他TLR具有表达差异，表明hTLR7-9属于hTLR当中一个新的亚家族。其中的hTLR8基因全长15 563 bp，定位于X染色体中的Xp22.2-Xp22.3。TLR8由25个富含亮氨酸重复序列的膜外区、跨膜区和TIR区组成，其功能发挥需要较低的pH环境。研究发现，TLR8在动物体内主要起到抗细菌、抗感染的作用，是Toll样受体家族当中非常重要的成员[2]。

2 TLR8配体(激活剂)及其种属特异性

TLR8和TLR7具有很多相似的激活剂，包括单链RNA和小分子核苷酸类似物，同时，TLR7和TLR8对RNA的序列特异性识别有一些序列偏好的报道，例如，富含GU和U的单链RNA分别优先被TLR7和TLR8识别[3]。有研究表明，含有GU基序的微核糖核酸可以从供体细胞转移到受体细胞，作为Toll样受体的配体发挥作用[8]，其中肿瘤细胞分泌的miRNA-21和miRNA-29α可被人TLR8或小鼠TLR7识别。TLR8的小分子激活剂包括咪唑喹啉类化合物 R848和CL097、噻唑并喹诺酮类分子CL075，这些小分子也可以同时激活TLR7。有些TLR7小分子激活剂，如R837和Loxoribine，并不能激活人和小鼠的TLR8，它们被称为TLR7特异性激活剂[9]。除识别病毒RNA外，TLR8也能够识别细菌RNA，这些细菌包括大肠埃希氏菌、牛分支杆菌、幽门螺杆菌和莱姆病螺旋体等[10]。TLR8识别配体并被激活具有明显的种属特异性，小鼠TLR8不能被上述任何TLR8/7激活剂激活，因此一度被认为没有活性。之后研究表明，TLR8激活剂和多聚胸腺嘧啶脱氧核糖寡核苷酸合并使用时能够激活小鼠TLR8。

后续有研究系统地比较了人、噬齿类(小鼠和大鼠)、家畜类(猪、牛、马、羊等)的TLR8，证实噬齿类的TLR8只有在多聚胸腺嘧啶脱氧核糖寡核苷酸存在时才能被TLR8/7激活剂激活，还发现小鼠和大鼠TLR8的 LRR14和LRR15之间的功能未知区域缺少了5个氨基酸，这一分子差异导致了TLR8的种属特异性[4]。与人TLR8不同，牛和猪的TLR8都可以被TLR7特异性激活剂R837活化，TLR8的这一种属特异性的分子基础目前还不清楚。TLR8的种属特异性也影响了生物种群的发展，亚马逊海牛和西印度海牛是容易灭绝的水生哺乳动物，有研究表明两者在TLR8上单核苷酸多态性的不同可能与西印度海牛种群减少以及亚马逊海牛种群扩张有关[5]。TLR8上单核苷酸多态性的差异导致了不同种群天然免疫的差异，或许随着对TLR8种属特异性的进一步探索，人们可以了解到更多动物种族灭绝的真相。

3 TLR8的分子结构与活化机制

TLR8的膜外区域包含20个至26个亮氨酸富集重复序列(leucine rich repeat，LRR)模块，并形成具有LRR蛋白特征的马蹄形右手弯曲螺线管。每个LRR单元包含了20到30个氨基酸；前10个氨基酸形成了一个在LRR蛋白中高度保守的共有基序。上述共有基序在马蹄形结构的凹面形成β链，而相邻LRR单元的β链相互作用又形成一个横跨马蹄结构凹面的β片。TLR8蛋白晶体结构解析表明，TLR8的膜外区为环形结构，与TLR1-6胞外区马蹄状结构不同[6]。TLR8的膜外区域还包含几个较大的插入序列和一个位于LRR14和LRR15之间的未知区域环。虽然对特定TLR 未知区域环的作用和加工处理过程尚不清楚，但多项研究已经证实，TLR8中的未知区域环的蛋白酶裂解是TLR8受体蛋白发挥信号功能所必需。

TLR8与单链RNA激动剂的共结晶结构已经得到解析，在此结构中TLR8具有两个不同的配体结合口袋，一个用于结合核苷尿苷，与保守的小分子配体结合位点相同；另一个用于结合二核苷酸和三核苷酸(如UG，NUG或UGN)。许多合成的TLR8配体RNA包含全硫代磷酸酯主链连接或复杂的二级结构，需要核糖核酸酶(RNase)的作用处理后才具备刺激活性。人类体内的RNase包括RNase T2和RNase A家族的转移酶型核酸内切酶[7]。当TLR8对合成RNA、细菌RNA和原生动物RNA进行免疫识别时，需要RNaseT2和RNase2这两种酶的协同降解作用[8]。

配体诱导的TLR1-6多聚化的观点已经被人们广泛接受，这些蛋白质的胞外区在配体刺激下形成了同源或异源的二聚体。与TLR1-6不同的是，无论有无激活剂存在，TLR8膜外区纯化蛋白都会以相似的二聚体晶体结构形式存在。没有活化时，TLR8膜外区环形C端侧面上升处通过多个氢键和其他分子间作用力相互结合形成二聚体。而在TLR8活化过程中，小分子激活剂结合在TLR8二聚体的聚合界面处，与TLR8 形成2∶2复合体，单个小分子激活剂与一个TLR8膜外区N-端的LRR11-14结合，同时与另一个TLR8膜外区的C-端LRR16-18通过多种非共价分子间作用力结合，这种结合引起了TLR8二聚体构象的轻微变化，以致引起二聚体膜外区环形C端的相互靠近，胞浆区的聚合及完全活化。

4 TLR8的细胞分布和信号通路

TLR8主要在髓系单核细胞、巨噬细胞和传统树突状细胞中表达，而在浆细胞样树突细胞和B细胞中仅有少量表达。与TLR7主要在浆细胞样树突状细胞和B细胞表达不同，TLR8则更多在单核细胞中表达，并且TLR8对于人类单核细胞检测革兰氏阳性菌至关重要[9]。在人类，中性粒细胞是血液中最丰富的白细胞，能迅速迁移到感染部位。但与单核细胞相比，中性粒细胞中TLR8的基础表达水平却比较低，而单核细胞可以产生IL-12p70来上调中性粒细胞和NK细胞中TLR8的表达。在很多情况下，不同细胞内TLR8信号的应答会受到抑制。人被人类免疫缺陷病毒1型(Human immunodificidncy virus-1,HIV-1)感染时，树突状细胞对于TLR8激活剂的应答会受到损害。转录因子p53是一种肿瘤抑制因子，在单核细胞向巨噬细胞分化过程中，p53的激活会降低巨噬细胞对TLR8激动剂的反应性[10]。

因为TLR8的研究相对滞后，而且TLR7和TLR8在识别配体方面非常相似，所以人们对TLR8信号通路的认识主要参照了TLR7信号通路。TLR8活化后，胞浆内的TIR结构域聚合，招募具有同源结构域的接头分子MyD88，后者吸引并活化蛋白激酶IRAK4和IRAK2。上述蛋白激酶激活下游连接分子TRAF6，从而激活IKK复合体并导致MAP激酶(MAPK，包括ERK1/2、p38和JNK)和NF-κB的激活，另一方面，TLR8的激活也可以激活干扰素调节因子来诱导干扰素(IFN)和干扰素刺激基因(IFN stimulated gene,ISG)的产生。

5 TLR8信号诱导细胞因子的作用

TLR8和TLR7在结构、基因定位和RNA感知方面相似，但它们主要存在于不同的外周血免疫细胞亚群中，这也同样突显了它们不同的生物学功能。TLR7主要在浆细胞样树突状细胞中表达，浆细胞样树突状细胞主要产生抗病毒的IFN-α。TLR8则主要在单核-巨噬细胞中表达，单核-巨噬细胞主要产生高水平的促炎细胞因子，如TNF-α、IL-12，这些基本都是Th1细胞相关的细胞因子。由TLR8激动剂激活的中性粒细胞在没有γ干扰素(IFN-γ)存在时，依然可以合成和释放EB病毒诱导基因3，但不能合成IL-12、IL-27、IL-35或IL-39[11]。另外，TLR8的激活可以引起NK细胞的活化，从而使NK细胞产生IFN-γ。而IFN-γ可以通过诱导Th2细胞中的γ干扰素信号传导因子来抑制Th2细胞的增殖，因此TLR8信号可以通过诱导IFN-γ来实现对Th2细胞的调节。TNF-α是由巨噬细胞分泌参与系统性炎症的细胞因子，可以作为一种内源性致热源来抑制病毒的复制，同时具有抗肿瘤和促进损伤组织愈合的作用。人单核细胞中TLR8激活后会促进IL-12p70的产生[12]，IL-12p70可以上调NK细胞中TLR8的表达，从而促进NK细胞的细胞毒性作用。同时，IL-12p70是一种已知的Th1分化激活剂，由IL-12家族细胞因子IL-12p35和IL-12p40组成。当TLR8和TLR2受到协同刺激时，将不再产生IL-12p35，而诱导IL-23p19的产生。IL-12p40和IL-23p19共同组成被称为IL-23的异源二聚体，它是一种强大的Th17分化增强剂。因此，TLR8和TLR2的共同信号应该会增加急性炎症反应，并提供从Th1免疫到Th17免疫增强的转变[13]。

6 TLR8信号与相关疾病

TLR8在多种类型免疫细胞中表达，并产生大量的炎性细胞因子，这对系统性红疮狼斑和其他自身免疫性疾病的治疗至关重要。TLR8位于X染色体上，主要在Xp22区域，距TLR7近端16 kb。全基因组扫描研究表明，Xp22号染色体上的基因变异与哮喘发病风险相关，同时，对哮喘患者进行研究发现，TLR8信号可以抑制Th2的细胞因子分泌，其诱导的IL-5可以通过促进血管活性物质的合成和释放来调节哮喘[14]。这些情况都表明，位于人类X染色体上的TLR8与人类过敏性疾病息息相关，从这一角度也可以解释女性自身免疫性疾病发病率高于男性的原因[15]。

在卵巢癌环境当中，CD4+调节性T细胞会通过糖酵解途径产生更高的葡萄糖消耗，从而比效应T细胞消耗更多的能量，抑制效应T细胞发挥功能，促进肿瘤生长[16]。TLR8信号的激活可以特异性地抑制调节性T细胞的葡萄糖代谢，抑制调节性T细胞的免疫抑制作用，从而增强抗肿瘤免疫[17]。与之相应的，TLR8还广泛表达在肿瘤细胞上，调节肿瘤的生长和功能，不同类型的人类肿瘤细胞可以通过肿瘤衍生的内源性代谢物环磷酸腺苷诱导T细胞衰老和功能障碍[18]。通过激活肿瘤细胞中的TLR8信号，可以降低肿瘤细胞中的环磷酸腺苷水平，显著提高肿瘤患者身体中肿瘤特异性T细胞的抗肿瘤疗效[19]。值得注意的是，在HIV感染期间，HIV的单链RNA暴露于细胞内体当中的Toll样受体，然后以特异性激活TLR8的方式，诱导调节性T细胞分泌细胞因子，这些可能有助于HIV在淋巴结中的传播以及引起HIV患者的轻度炎症[20]。

在慢性乙型肝炎患者中，TLR8的激活可能会诱导机体产生抗病毒免疫力并推动机体的功能性治愈，Selgantolimod是一种新的TLR8激动剂，在口服抗病毒治疗或病毒抑制治疗的慢性乙型肝炎患者中进行了评估，具有一定的疗效[21]。

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的2019冠状病毒病自2020年3月以来出现大流行，严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2的确切致病机理仍然没有完全清楚，但我们可以从冠状病毒家族(如SARS-CoV和MERS-CoV)的可用数据来更好地理解严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2。TLR在识别病毒颗粒和激活先天免疫系统中发挥重要作用，但TLR7/8激活剂咪喹莫特可促炎性细胞因子的产生，在感染后期可能会导致细胞因子风暴和持续炎症等副作用。因此，咪喹莫特适合应用于COVID-19感染的早期阶段[22]。

三叉神经病理性疼痛是非常常见的颅神经疾病，其发病机制尚未完全阐明。最近有研究发现，在部分眶下神经结扎诱导的小鼠三叉神经性疼痛模型中，TLR8在三叉神经节神经元中的表达持续升高，而TLR8在三叉神经节中的缺失或敲除可减轻部分眶下神经结扎术诱导的机械性痛觉异常，减少三叉神经节中促炎细胞因子的表达。同时已经证明TLR8通过激活MAPK介导神经炎症参与了三叉神经性疼痛的维持，这表明靶向TLR8信号可能对治疗三叉神经性疼痛有效[23]。

TLR8作为天然免疫受体，本身可以进行病原体的识别。并且TLR8主要激活下游的炎症因子，在部分疾病当中，由于TLR8的激活也会对机体产生过度损伤和自身免疫。这时，针对病情合理地使用TLR8激活剂和抑制剂，往往可以达到比较良好的治疗效果。综上所述，TLR8与自身免疫性疾病、传染性疾病、癌症和其他神经性疾病都具有密不可分的联系，这对于动物疾病治疗来讲非常具有借鉴意义。

7 展望

因为缺乏TLR8激动剂特异作用效应的动物模型，所以关于TLR8及其在疾病中的作用研究仍然受到限制。到目前为止，与TLR8活性遗传调节相关的研究仅限于灵长类动物，然而有证据表明，TLR8在免疫方面的作用可以使用羊和牛等动物模型来进行研究[24]。TLR8对于调节性T细胞的调控作用，也显露出TLR8在抗肿瘤免疫中的关键作用。TLR8激动剂凭借其诱导IFN-γ/TNF-α的能力，也表现出抗病毒、抗癌症和作为疫苗佐剂的巨大潜力。相信在未来，人们一定能探究到TLR8更多的功能，从而使TLR8能够在调节免疫系统治疗疾病中发挥更多的作用。