沙门氏菌感染相关的鸡Toll样受体研究进展

李春华，缪德年，夏 叶，孙莹慧，魏晓锋

(1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；2.上海实验动物研究中心，上海 201203)

沙门氏菌(Salmonella)感染导致的常见疾病有鸡白痢、伤寒和副伤寒等，影响家禽的生长和生产性能，甚至引起家禽死亡，使养禽业蒙受巨大经济损失。另外，污染的家禽肉蛋产品是一种常见的食源性沙门氏菌污染源，危害人类的公共卫生安全。禽沙门氏菌病呈垂直和水平方式传播，且存在隐性感染，使得禽沙门氏菌病的防治变得困难。近代养禽业生产中持续饲喂抗生素来防治沙门氏菌病，不仅造成了沙门氏菌耐药性的增强，还导致了过度使用抗生素以及残留问题。沙门氏菌能否感染发病通常与机体状况有关，在抵抗沙门氏菌感染的过程中，鸡只本身的免疫系统起决定作用；而鸡Toll样受体(chicken Toll-like receptors,chTLRs)在天然免疫方面发挥重要作用，因此，沙门氏菌感染与免疫中Toll样受体的研究逐渐兴起，本文综述了沙门氏菌感染相关的鸡Toll样受体研究进展。

1 Toll样受体概述

天然免疫系统是机体的第一道防线，通过模式识别受体实现对病原体的早期识别，诱导天然免疫反应的发生。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是模式识别受体的一种，可识别特定的病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)，快速激活天然免疫系统，使机体产生抵御反应。TLRs是一种Ⅰ型跨膜蛋白，其结构高度保守，包括胞外区、跨膜区和胞内区3个部分。富含亮氨酸重复序列(leucine rich repeat,LRR)的胞外区位于蛋白质N端，是配体结合结构域，促使蛋白质间的黏附，参与识别相应的PAMPs[1]；跨膜区是富含半胱氨酸的结构域，决定TLRs分子的亚细胞定位；胞内区位于蛋白质C端，具有与白细胞介素-1受体高度同源的结构域，又称为 Toll/IL-1受体 结构域[2]。机体在LRR胞外结构域的介导下识别病原体的PAMPs，通过Toll/IL-1受体结构域募集并结合下游的接头分子，参与信号传导并促使信号级联反应发生；活化下游转录因子，表达干扰素(interferon,IFN)、α肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor-α,TNF-α)等一系列炎性因子，参与宿主对抗相应病原微生物入侵的天然免疫反应[3]。

2 鸡TLRs种类

TLRs最早发现于果蝇体内，之后在人体细胞表面发现了与之同源的Toll样蛋白，该蛋白在天然免疫过程中起重要作用。禽类的先天免疫研究较为迟缓，进入21世纪后，随着鸡基因组序列测定的完成，一些鸡TLRs的种类逐渐被揭示和发现。目前已发现的鸡TLRs有10种，分别是chTLR1LA、chTLR1LB、chTLR2A、chTLR2B、chTLR3、chTLR4、chTLR5、chTLR7、chTLR15 和 chTLR21[4],在健康鸡的外周血单核细胞中检测到10种chTLRs[5]。

这些chTLRs基因的染色体定位有所不同，chTLR1LA、chTLR1LB、chTLR2A、chTLR2B和chTLR3位于染色体4；chTLR4位于染色体17；chTLR5、chTLR15 位于染色体3；chTLR7位于染色体1；chTLR21位于染色体11[6]。chTLR1LA、chTLR1LB、chTLR2A和chTLR2B是TLR1和TLR2在进化过程中基因倍增的产物，chTLR2A和chTLR2B与哺乳动物的单一TLR2基因同源；chTLR3、chTLR4、chTLR5、chTLR7同源于其他脊椎动物的TLRs；TLR8、TLR9和TLR10存在于哺乳动物中，但在鸡中缺失；chTLR15是鸟类特有的，chTLR21则与鱼类和两栖动物的TLR21同源。

3 与沙门氏菌感染相关的鸡Toll样受体

3.1 chTLR1LA、chTLR1LB、chTLR2A、chTLR2B

chTLR1LA、chTLR1LB、chTLR2A和chTLR2B均位于细胞膜上，相互作用，协同识别细菌细胞壁的组成成分，如细菌肽聚糖(PGN)、脂多糖(LPS)和脂质。这4种蛋白具有组合功能特征，哺乳动物TLR2和TLR1、TLR6、TLR10形成的二聚体可识别的激动剂，也可被chTLR1L与chTLR2 相互作用形成的二聚体所识别。

chTLR2在抵抗鸡沙门氏菌感染中发挥较大作用，感染沙门氏菌后，chTLR2在鸡脾脏及盲肠中的表达量增加。有研究发现chTLR2B的分布表达比chTLR2A更为广泛，chTLR2主要分布于免疫组织系统中，在一定程度上说明chTLR2与先天性免疫关系十分密切[7]。用肠炎沙门氏菌感染济宁百日鸡，检测发现试验组在感染后第3、7、21、28、35天盲肠组织中chTLR2表达量与对照组相比差异显著[8]；感染后第3天chTLR2和chTLR4的表达量比第1天有所升高，有利于机体早期免疫应答的激活。

不同品种鸡的chTLR1LA、chTLR1LB、chTLR2A和chTLR2B存在多态性，在chTLR1LA和chTLR1LB有27个氨基酸多态位点，其中14个位点存在于chTLR1LA、13个位点存在于chTLR1LB；chTLR2A和chTLR2B有10个氨基酸多态位点，其中6个位点存在于chTLR2A、4个位点存在于chTLR2B；对沙门氏菌病具有抗性的白来航鸡品种在chTLR1LA和chTLR1LB分别存在一个独特的多态位点A645T和L275P，LRRCT区域负责配体结合，LRRCT中的L275P可能影响chTLR1LB对配体的识别功能[9]，这些发现有助于揭示不同品种鸡对疫病的抗性与易感性的差异。

3.2 chTLR3、chTLR7

chTLR3和chTLR7在B/T细胞等组织细胞中广泛表达，可以识别一些人工合成的小分子化合物、病毒单链RNA和双链RNA等，主要参与抗病毒感染反应[10]。不同品种鸡的chTLR3、chTLR7存在多态性，chTLR3存在7个氨基酸多态位点：D14V、R345S、G362E、R459K、A540V、A649V、T713S[11]；chTLR7存在4个氨基酸多态位点：V91L、S135T、P669S、V876M；对H7N1型高致病性禽流感病毒具有抗性的白来航鸡具有R345S、G362E、R459K、P669S、V876M 5个多态位点，而白丝羽乌骨鸡具有除S135T之外的所有多态位点，可以作为研究不同品种鸡抗病毒病性状的良好模型。

3.3 chTLR4

chTLR4位于细胞膜上，可识别细菌的脂多糖，激活宿主的先天免疫以抵抗细菌感染。多数研究发现，鸡感染沙门氏菌后，chTLR4的表达量上调。有人研究了沙门氏菌感染后易感和抗性品种鸡盲肠淋巴组织中与载菌状态相关的先天性免疫反应因子的基因表达，发现抗性品种的chTLR4基因表达量在感染后第1、2、4周显著高于易感品种。给鸡皮下注射肠炎沙门氏菌，发现感染组三黄鸡脾脏中chTLR4表达量上调显著，表明被沙门氏菌感染激活的chTLR4参与了免疫应答过程[12]。

研究显示沙门氏菌易感性与chTLR4基因多态性存在一定相关性，chTLR4基因有可能为宿主抗沙门氏菌感染相关的候选免疫基因。研究发现chTLR4基因第3外显子区域存在14个突变位点，其中5个导致了氨基酸改变，分别是：Gly225Glu、Glu301Asp、Arg343Lys、Tyr383His和 Gln611Arg，这5个氨基酸均位于chTLR4胞外区的LRR配体识别区域；其中Tyr383His和 Gln611Arg为非保守替代的氨基酸，仅存在于易感品种鸡。有人研究了SLC11A1和chTLR4两个候选基因与鸡沙门氏菌载菌量的效应，发现经沙门氏菌PT4株感染后，盲肠、卵巢、脾脏和肝脏的载菌量不同；应用PCR-SSCP进行多态性分析，发现257 bp的chTRL4基因片段中存在3个SNPs，分别位于外显子2的Leu73和Glu/Lys83和内含子2，突变位点与上述4个器官的载菌量差异有关，在盲肠和卵巢中呈显著相关。研究发现chTLR4基因内含子区存在的SNP突变位点(G156C)与脾脏载菌量呈中度相关。对引进品种鸡和地方品种鸡进行 chTLR4 基因序列检测分析，发现36个SNPs多态位点，这些突变位点与机体对病原菌的抗性具有重要作用[13]。研究10个不同品种鸡的chTLR4，发现了19个SNPs，其中4个与不同品种鸡的抗病力相关，分别为G247A(Glu83Lys)、A896T(Arg298Ser)、A1104C(Ser368Arg)和 A1832G(Gln611Arg)[14]；人工感染白来航雏鸡的试验结果显示，与鸡抗沙门氏菌能力显著相关的是G247A，基因型GG鸡在感染后死亡率较高，而基因型AG和AA鸡的死亡率明显低于前者。

3.4 chTLR5

chTLR5在具有免疫学和基质来源的组织和细胞中广泛表达，与哺乳动物TLR5具有保守的序列和结构相似性。鞭毛是沙门氏菌的一种毒力因子，也是TLR的PAMPs之一。chTLR5可识别细菌鞭毛蛋白成分，但对来源于不同种类细菌的鞭毛蛋白存在差异性识别；chTLR5始终比hTLR5对鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白产生更强的应答，细菌鞭毛蛋白中的单个氨基酸替换可改变物种特异性TLR5反应，影响沙门氏菌感染的宿主范围和易感性。沙门氏菌血清型的生物学差异(全身性或肠道限制性定殖)与鞭毛的存在与否有关，无鞭毛的鼠伤寒沙门氏菌fliM突变体能逃避chTLR5的识别，入侵定殖率升高，引起的全身感染能力增强；沙门氏菌鞭毛则可诱导chTLR5的表达上调，能调节CD4+T类群的免疫反应，从而有利于清除细菌，减轻感染[15]。chTLR5在限制鞭毛沙门氏菌进入鸡全身部位，抵抗沙门氏菌的全身性感染中发挥至关重要的作用。

3.5 chTLR15

TLR15是禽特有的一种受体，具有保守的氨基酸序列，在鸡脾脏、法氏囊和骨髓中表达，chTLR15识别毒力相关的蛋白酶，介导的先天性免疫反应有助于禽类抵御细菌入侵[16]。肠炎沙门氏菌感染鸡的盲肠中chTLR15表达显著上调，且与chTLR2的诱导呈显著相关性；在受到热灭活的肠炎沙门氏菌刺激后，鸡胚成纤维细胞中诱导产生chTLR15。有人研究了海兰褐鸡TLR15基因的生物学信息及组织表达，发现chTLR15在肝脏和肺部表达较少，主要在脾脏中表达，且主要分布在细胞质中[17]。沙门氏菌易感鸡和抗性鸡嗜异染细胞中的chTLR15存在差异表达，在肠炎沙门氏菌的刺激下，两组鸡的嗜异染细胞chTLR15 mRNA表达均显著增加；与易感鸡相比，无论在肠炎沙门氏菌刺激之前或之后，抗性鸡的嗜异染细胞中都具有更高的chTLR15 mRNA表达水平，chTLR15基因表达上的差异解释了易感品种与抗性品种对感染敏感性的差异。清远麻鸡和白耳鸡的chTLR15基因外显子存在3个SNPs位点，分别是G168A、C726T和A1166G，其中 C726T位点可能与鸡白痢沙门氏菌病抗性相关[18]。

3.6 chTLR21

chTLR21是一种先天的CpG DNA受体，主要在B细胞和巨噬细胞等细胞亚群中表达，定位于细胞的内质网上。chTLR21被称为哺乳动物TLR9的功能同系物，二者均识别微生物的DNA，激发先天性免疫反应，协同诱导获得性免疫反应[19]。

肠炎沙门氏菌的细菌DNA可引起chTLR21转染的HEK293细胞内NF-κB的活化，而不能诱导hTLR9转染的HEK-293细胞内NF-κB的活化，表明chTLR21比hTLR9具有更广泛的CpG DNA配体特性，能够识别更广泛的物种[20]。chTLR21在成年家禽、雏禽和鸡胚的多种组织中表达，促使新生鸡可对ODNs迅速做出反应；对鸡胚和雏鸡进行 ODNs 药物处理，可增强其抗沙门氏菌感染能力。有研究进一步证实chTLR21能被含有不同的CpG六聚体基序，且长度范围在15个-31个核苷酸的CpG ODN活化，chTLR21具有广泛的CpG ODN序列识别特性，可以识别微生物的各种DNA相关分子模式，从而启动家禽对感染的先天免疫反应[21]。将chTLR21的激动剂CpG ODN 2007与基于聚乳酸-乙醇酸(PLGA)的空心剂结合，成功制备了具有强大免疫增强能力的新型佐剂CpG-NP，其在体内和体外试验均表现出对鸡有效而持久的免疫刺激能力，在疫苗开发中具有广泛的应用潜力[22]。

4 展望

由沙门氏菌感染引起的疾病不仅给家禽生产造成巨大经济损失，也导致人类食源性疾病。传统的沙门氏菌病防治方法不能满足对禽产品安全的需求，随着分子遗传育种的开展，选择抗沙门氏菌的品系进行育种已经成为一种趋势。鸡抗沙门氏菌感染不仅与宿主的功能基因有关，还受鸡的表观遗传修饰、鸡肠道微生物菌群、鸡不同品种或品系等的影响[23]。chTLRs参与机体抵抗病原体感染的反应，在沙门氏菌感染引发的机体免疫应答中发挥重要作用，是一种抗性相关基因，也是遗传育种研究中的重要候选基因。本文综述了与沙门氏菌感染相关的chTLRs，不同品种鸡chTLRs的多态性，及其对沙门氏菌的抗性或易感性的影响，可为家禽抗病育种与沙门氏菌病防治提供参考。