灵芝益寿丸微生物限度检查法的建立

孙华颖， 杨巧月， 刘 勤， 向 东

(1.云南省食品药品监督检验研究院,云南 昆明 650106；2.昆明医科大学海源学院,云南 昆明 650106)

云南拥有丰富珍贵的地方中药和民族药资源，为了保证其质量，必须建立专门的质量检验方法。但中成药成分复杂，多种组方药材含有抑菌物质，常规微生物限度检测法极容易出现假阴性，从而发生微生物污染漏检的情况。

药品微生物限度检查可反映非无菌制剂中原辅料、生产工艺、运输、储藏等受到微生物污染的程度，是药品生产和质量控制的重要手段[1]。为了确保中药临床使用的安全性，2020年版《中国药典》[2]对口服制剂的微生物污染情况制定了具体的管理规定和控制要求。

灵芝益寿丸是云南省名老中医罗铨教授的经验方，主要由灵芝、制何首乌、人参、三七、当归等药材组成[3]，查阅文献[4-8]发现，方中部分成分具有抑菌作用，但目前尚无其微生物限度检查方法的报道。因此，本实验建立了适合灵芝益寿丸微生物限度检查的方法，以期为其质量控制提供参考。

1 材料

1.1 药物 灵芝益寿丸由云南省中医医院提供，批号20190748、20191124、20191125。

1.2 培养基及稀释剂 胰酪大豆琼脂培养基TSA (批号200223)、胰酪大豆胨液体培养基TSB(批号2003062)、沙氏葡萄糖琼脂培养基SDA(批号2101062)均购自北京三药开发公司。

1.3 菌株 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、沙门菌[CMCC(B)50094]均购自中国食品药品检定研究院，经专家进行理化特性鉴定后均符合试验要求。

2 方法

2.1 菌液制备 将“1.3”项下菌株按照相关要求制成适宜浓度的菌悬液，使试验时终浓度不大于100 cfu/mL[9-16]。

2.2 供试液制备

2.2.1 不含中和剂 取丸剂10 g，加入胰酪大豆胨液体培养基至100 mL，制成均匀的1∶10供试液，取5 mL加入胰酪大豆胨液体培养基至10 mL，制成均匀的1∶20供试液；另取2 mL，加入胰酪大豆胨液体培养基至10 mL，制成均匀的1∶50供试液，即得。

2.2.2 含中和剂 取丸剂10 g，加入含0.3%卵磷脂、5%聚山梨酯-80的胰酪大豆胨液体培养基至100 mL，制成均匀的1∶10供试液，按“2.2.1”项下方法依次稀释至1∶20、1∶50，即得。

2.3 计数方法适用性试验

2.3.1 常规平皿法 取“2.1”项下菌液0.1 mL，加到“2.2.1”项下1∶10供试液9.9 mL中，混匀，作为试验组；取稀释液0.1 mL，加到“2.2.1”项下1∶10供试液9.9 mL中，混匀，作为供试品组；取“2.1”项下菌液0.1 mL，加到稀释液9.9 mL中，混匀，作为菌液对照组。分别取1 mL注皿(1 mL/皿)，平行制备2个平皿，加入15～20 mL温度不超过45 ℃熔化的TSA或SDA培养基中，混匀，凝固，倒置培养，计算平均菌落数。

2.3.2 稀释法 取“2.1”项下菌液0.1 mL，加到“2.2.1”项下1∶20、1∶50供试液9.9 mL中，混匀，作为试验组，其他同“2.3.1”项。取1 mL注皿(1 mL/皿)，平行制备2个平皿，加入15～20 mL温度不超过45 ℃熔化的TSA或SDA培养基中，混匀，凝固，倒置培养，计算平均菌落数。

2.3.3 稀释法结合添加中和剂法 取“2.1”项下菌液0.1 mL，加到“2.2.2”项下1∶20、1∶50供试液9.9 mL中，混匀，作为试验组，其他同“2.3.1”项。取1 mL注皿(1 mL/皿)，平行制备2个平皿，加入15～20 mL温度不超过45 ℃熔化的TSA或SDA培养基中，混匀，凝固，倒置培养，计算平均菌落数。

2.4 回收率计算 公式为回收率=[(试验组平均菌落数-供试品组平均菌落数)/阳性菌组平均菌落数]×100%。

3 结果

3.1 常规平皿法 表1显示，3批样品中铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉回收率均大于0.5，而金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均无菌落生长，回收率为0，即本品对后两者有较强的抑制作用，表明常规平皿法不适用于需氧菌的计数检查；霉菌酵母菌回收率均符合2020年版《中国药典》四部要求，故可采用该方法进行上述菌种的计数检查。

表1 常规平皿法回收率试验结果(n=3)

3.2 稀释法与稀释法结合添加中和剂法 根据表1结果选择金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，分别按“2.3.2”“2.3.3”项下方法操作，结果见表2～3。由此可知，稀释倍数不同，2种菌株回收率有明显差异，并且稀释倍数越高，回收率越高。

采用稀释法且当稀释倍数增加到50倍时，金黄色葡萄球菌回收率有所提高，但仍小于0.5，表明供试液仍有抑菌性；枯草芽孢杆菌回收率较稀释10、20倍时显著增高，而且在0.5～2.0范围内，说明供试液抑菌性已经基本消除。

采用稀释法结合添加中和剂法时，相同稀释倍数下的回收率明显高于采用稀释法时，当稀释倍数增加到20、50倍时，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率在0.5～2.0范围内，达到相关标准，表明供试液抑菌作用已完全消除，但1∶20(1 mL/皿)、1∶50(1 mL/皿)回收率差异不明显。

表2 金黄色葡萄球菌回收率试验结果(n=3)

表3 枯草芽孢杆菌回收率试验结果(n=3)

3.3 计数方法适用性试验 2020年版四部《中国药典》[3]规定，若方法适用性试验回收率符合要求，应以更高稀释级供试液代替最低稀释级的供试液进行检查。因此，本实验采用0.3%卵磷脂、5%聚山梨酯-80作为稀释剂，对需氧菌计数进行方法学考察[1∶20(1 mL/皿)]，需氧菌、霉菌酵母菌计数分别按“2.3.3”“2.3.1”项下方法操作，结果见表4。

由此可知，3批样品中各菌株回收率均达到标准，在0.5～2.0范围内，表明供试液抑菌作用已经消除；敏感菌株回收率升高至0.5以上，并且铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉回收率较“3.1”项下也有大幅提高。

表4 计数方法适用性试验结果(n=3)

3.4 控制菌检查

3.4.1 常规法 取1∶10供试液制备试验组，稀释液制备阴性组，适宜浓度大肠埃希菌、铜绿假单胞菌制备阳性组。按照2020年版《中国药典》四部方法检查大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌，取3批样品，每批10 g，直接接种到200 mL TSB中，作为样品组；同法加入适宜浓度沙门菌菌悬液，作为试验组；取稀释液适量，作为阴性组，再按照药典方法检查沙门菌，结果见表5。

3.4.2 稀释法 取“2.2”项下1∶20供试液制备试验组，稀释液制备阴性组，“2.2”项下1∶20供试液制备样品组。取大肠埃希菌、铜绿假单胞菌菌悬液，作为试验组；取稀释液10 mL，作为阴性组。按照2020年版《中国药典》四部方法检查大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌，取“2.2”项下1∶20供试液10 mL，直接接种到200 mL TSB中，作为样品组；同法加入适宜浓度沙门菌菌悬液，作为试验组；取稀释液适量，作为阴性组，再按照药典方法检查沙门菌，结果见表5。

3.4.3 稀释法结合添加中和剂法法 取“2.2”项下1∶20供试液10 mL，加到100 mL含0.3%卵磷脂、5%聚山梨酯-80液体培养基中制备样品组；取适宜浓度大肠埃希菌、铜绿假单胞菌菌悬液，制备试验组；取稀释液适量，制备阴性组。按照2020年版《中国药典》四部方法检查大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌，取“2.2”项下1∶20供试液10 mL，直接接种到含0.3%卵磷脂、5%聚山梨酯-80的200 mL TSB中，作为样品组；同法加入适宜浓度沙门菌菌悬液，作为试验组；取稀释液适量，作为阴性组，再按照药典方法检查沙门菌，结果见表5。

表5 控制菌检查结果

3.4.4 结果分析 3种方法下阳性组均能检出大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌，而阴性组均无菌落生长，即均可用于控制菌检查。根据2020年版《中国药典》四部规定结合实验过程简便易操作的原则，可选用常规法。

4 讨论与结论

微生物限度检查法的适用性试验[9]是在无抑菌作用的环境下，将样品在不同环节受到污染的微生物能被充分地分离检查出来。由于中药制剂成分复杂，经常使用的普通检查法[12]往往不适用，通常需要降低、去除样品中某些组分的抑菌作用来减少对检查结果的干扰[17-18]，避免漏检、误检。

本实验结果表明，灵芝益寿丸具有较强的抑菌活性，故对其进行微生物限度检查试验时必须消除上述作用，避免产生结果的偏差。由于稀释法、中和剂法等不能完全消除灵芝益寿丸抑菌性，而且供试液中大量不溶物严重影响了薄膜过滤效率，甚至堵塞滤膜，导致试验失败，故本实验将稀释法[1∶20(1 mL/皿)]与添加0.3%卵磷脂和5%聚山梨酯-80相结合来进行需氧菌总数计数适用性试验，再采用常规法进行霉菌酵母菌总数、控制菌检查，发现各菌株回收率高，而且在药典要求的范围内，同时该方法不需要复杂昂贵的设备，操作简单，操作时间短，结果准确可靠。

综上所述，本实验所建立的微生物限度检查法解决了灵芝益寿丸假阴性问题，对云南地方中药和民族药资源的推广有促进作用，也可应用于其他地区药材的质量检验，从而为中医药事业发展作出贡献。