玉米NF-Y转录因子基因ZmNF-YB13响应干旱和盐胁迫的功能分析

张彤彤 郑登俞 吴忠义 张中保 于荣

（1.首都师范大学生命科学学院，北京 100048；2.北京市农林科学院生物技术研究所，北京 100097）

玉米（Zea mays L.）适应性强，种植面积广，是重要的粮食、经济、饲料作物［1-2］，而干旱［3-5］、盐碱化［6-8］严重影响玉米的生产发展，因此提高玉米对干旱、盐碱化等非生物胁迫的抗性十分重要。NF-Y家族是一类可以与启动子序列中的CCAAT-box结合的转录因子，又叫亚铁血红素激活蛋白（hemeactivator proteins，HAPs） 或 CCAAT结 合 因 子（CCAAT-binding factor，CBF）， 包括 NF-YA（CBFB/HAP2）、NF-YB（CBF-A/HAP3）、NF-YC（CBFC/HAP5）3个亚家族［9］，在植物胚胎和种子发育、胁迫响应等进程中发挥重要作用［10］。在拟南芥、水稻、小麦、油菜、高粱等植物中都有NF-Y家族功能的研究报道。拟南芥NF-YA5基因在干旱胁迫诱导下高表达；和野生型相比，敲除NF-YA5的拟南芥叶片失水更多；相反，过表达NF-YA5的拟南芥植株叶片失水少，抗旱性强［11］。过表达AtNF-YA2、A3、A7和A10的拟南芥植株对干旱等非生物胁迫的耐受性增强［12］。水稻中，Das等［13］报道OsNFYB9在水稻中的异位表达推迟了抽穗期，而且水稻OsNF-YB9能与花发育的关键调节因子MADS 1相互作用。在干旱胁迫下，水稻OsNF-YA7表达量上调，过表达OsNF-YA7的水稻抗旱性增强［14］。过表达OsHAP2E的转基因水稻增强了对盐碱化和干旱的抗性［15］。小麦中，TaNF-YA10-1基因在拟南芥中异源表达显著提高了拟南芥对干旱胁迫的耐受性［16］。油菜BnNF-Ys基因家族中的多个基因在盐、干旱或ABA处理后表达量迅速上调［17］。在盐、甘露醇、ABA、低温和高温不同胁迫下，高粱SbNF-YB7、B12、B15和B16均受较强的诱导表达［18］。除拟南芥、水稻、小麦、油菜和高粱外，茶树 CsNF-YAs［19］、苹果 MsNF-YB21［20］和大蒜AsNF-YC8［21］等均在非生物胁迫下诱导表达。总之，NF-Y在参与植物耐旱、抗盐等过程中发挥重要作用，是植物抗逆育种的重要蛋白。

在玉米中，对NF-Y家族的报道还较少。ZmNFYA3能够分别与bHLH92、FAMA和MYC4的启动子区结合，提高抗旱性和耐高温性［22］。玉米ZmNFYC8与拟南芥的NF-YC2基因高度同源，而NF-YC2基因在植物开花过程中起调控作用［23］。我们前期工作发现，ZmNF-YB13（GRMZM5G804893）基因在严重干旱胁迫条件下被诱导表达并且表达量较高［24］。本研究从玉米中克隆了ZmNF-YB13基因，在序列分析基础上分析该基因在玉米不同组织器官以及不同逆境胁迫下的表达模式，并分析该基因异源表达转基因拟南芥的耐旱、抗盐表型，以期为耐旱、抗盐性分子机制解析和分子育种提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

玉米自交系品种B73用于玉米ZmNF-YB13全长cDNA的克隆及表达模式分析；拟南芥哥伦比亚生态型Col-0用于ZmNF-YB13异源表达载体的转化；大肠杆菌Trans1 T1购自北京全式金生物技术有限公司；农杆菌GV3101为本实验室保存；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购于北京擎科生物技术有限公司；过氧化物酶（POD）活性检测试剂盒、丙二醛（MDA）含量测定试剂盒等购于北京索莱宝科技有限公司；限制性内切酶等购于宝生物工程（大连）有限公司，常用试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 玉米ZmNF-YB13 cDNA的克隆及生物信息学分析

1.2.1.1 玉米ZmNF-YB13 cDNA的克隆 提取玉米叶片总RNA，反转录获得cDNA，设计引物pZmNFYB13-FP、pZmNF-YB13-RP，利用高保真DNA聚合酶对目的基因进行PCR扩增。PCR产物经胶回收后连接至T5 Zero载体，获得单克隆后送上海生工进行菌落测序。各引物序列见表1。

表1 本实验所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.1.2 玉米ZmNF-YB13的序列分析及系统发育分析 通过ProParam工具（http://web.expasy.org/protpa ram/）预测ZmNF-YB13基因编码的蛋白分子量和理论等电点；分别使用SPOMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）、SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.exp asy.org/）分析蛋白二级结构、空间结构；应用TMH MM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）进行蛋白跨膜预测分析；使用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）网站进行启动子区顺式作用元件分析。

1.2.2 ZmNF-YB13基因组织差异和胁迫处理表达分析 选取生长在温室（光照16 h，28℃，黑暗8 h，23℃）中三叶一心时期的玉米幼叶、幼根和茎，选取田间种植的玉米吐丝期穗位叶、根、花丝、雄穗，授粉后10 d的幼胚，-80℃冻存。

将玉米自交系B73幼苗生长于含有营养液的水培桶中，在水培桶中放入通氧石，通过气泵（45 min通气/30 min不通气，间歇循环）给植物提供氧气。玉米幼苗正常生长至三叶一心时期分别进行脱水、高盐、冷、PEG、脱落酸（ABA）以及茉莉酸（JA）处理。脱水处理为将幼苗从水培桶中取出，用吸水纸吸收表面多余水分，室温放置，自然脱水；盐、PEG处理为将幼苗分别放入含200 mmol/L NaCl和20% PEG的营养液中；冷处理为将含有营养液的幼苗放置在4℃冰箱；分别取处理0、1、2、5、10和24 h后的地上部和根，-80℃冻存。ABA和JA处理分别将含有100 μmol/L ABA和100 μmol/L JA的溶液喷施在幼苗叶片上，并包裹上保鲜膜，分别取处理0、1、2和5 h后的叶，-80℃冻存。

使用冻存的材料提取RNA，逆转录后作为qPCR模板。设计特异性引物pZmNF-YB13RT-FP、pZmNF-YB13RT-RP，以GAPDH为内参基因，对不同处理的cDNA进行实时荧光扩增。每组实验设3个生物学样本，每个生物学样本设3个技术重复，数据为3个生物学重复平均值±标准误差。应用2-ΔΔCT方法分析ZmNF-YB13基因的表达模式。

1.2.3 植物异源表达载体pCAMBIA3301：ZmNFYB13的构建及拟南芥遗传转化

1.2.3.1 异源表达载体构建 参照殷龙飞等的方法［25］构建异源表达载体。

1.2.3.2 拟南芥遗传转化 将重组质粒pCAMBIA3301∶ZmNF-YB13转化农杆菌菌株GV3101，通过浸花法侵染拟南芥Col-0，22℃黑暗条件下培养24 h取出拟南芥苗常规培养。单株收取T0代种子，利用含有除草剂草铵膦的培养基进行筛选获得T1代种子。提取T1代幼苗叶片基因组DNA为模板，利用引物pZmNF-YB13T-FP、pZmNF-YB13T-RP进行PCR检测。单株收获阳性植株种子并加代获得T3代纯合植株。

1.2.4 转基因拟南芥的表型鉴定

1.2.4.1 1/2 MS培养基中不同逆境和激素处理下转基因拟南芥的表型分析 将异源表达ZmNF-YB13转基因拟南芥3个株系及野生型拟南芥种子4℃春化3 d后，用0.5% NaClO（有效氯）消毒10 min，接着用无菌蒸馏水清洗5次，然后播种于1/2 MS培养基上。培养7 d后，各株系选取5株生长一致的幼苗移至对照以及分别含100 mmol/L NaCl、200 mmol/L甘露醇、75 μmol/L JA和50 μmol/L ABA 的 1/2 MS培养基上，各设3个重复，垂直放置于22℃，16 h光/8 h暗的温室中培养，8 d后拍照并使用ImageJ软件统计根长。

1.2.4.2 土壤中转基因拟南芥植株的表型分析及生理指标的测定 选取1周大小的发育良好、生长状态一致的转基因拟南芥及野生型对照植株移栽至土壤中，分别设置对照组、干旱组、盐处理组，每组4盒，每盒4株幼苗，各组设3个生物学重复。幼苗在营养土中生长3周后，对干旱组进行3周自然干旱处理和两天覆水处理；对盐处理组浇灌300 mmol/L NaCl进行一周胁迫处理。表型观察后，测定植株的MDA含量和POD的活性。

1.2.5 数据分析 所有试验均设置3次重复，数据为3个生物学重复平均值±标准误差。使用生物统计学软件SPSS 25.0，采用单因素方差对数据进行显著性分析，不同字母表示在0.05水平上有显著差异，*表示 0.05 水平上显著差异，**表示 0.01 水平上极显著差异。

2 结果

2.1 ZmNF-YB13基因的克隆与生物信息学分析

通过RT-PCR的方法，从玉米中扩增得到ZmNF-YB13基因，全长537 bp，编码178个氨基酸。对ZmNF-YB13的保守结构域进行分析，发现该基因含有NF-Y家族所特有的保守结构域。生物信息学分析表明，ZmNF-YB13蛋白分子量为18.9 kD，理论等电点为6.83，不具跨膜结构，蛋白二级结构中无规则卷曲所占比例最大（59.93%）。系统进化分析发现，ZmNF-YB13蛋白与水稻中的OsHAP3B亲缘关系最近（图1）。

图1 ZmNF-YB13基因的系统进化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of gene ZmNF-YB13

利用PlantCARE对ZmNF-YB13基因上游2 000 bp DNA序列进行顺式作用元件分析发现，该启动子含有启动子核心元件TATA-box、脱水反应相关元件DRE、低温响应元件LTRE以及光反应响应元件G-box和Box4。此外，还含有ABA激素响应元件ABRE和JA激素响应元件TGACG-motif。

2.2 ZmNF-YB13基因的表达模式分析

2.2.1 玉米ZmNF-YB13基因的组织特异性分析 qPCR分析发现，ZmNF-YB13基因在不同组织中均有表达。在花丝中的表达量最高，在成熟根、茎、雄穗、幼根和幼胚里的表达量较低，在穗位叶和幼叶里的表达量最低（图2）。

图2 ZmNF-YB13基因在玉米不同组织中的差异表达分析Fig.2 Tissue-specific expression pattern of gene ZmNFYB13 in maize

2.2.2 玉米ZmNF-YB13基因的诱导表达分析 通过qPCR对ZmNF-YB13在不同逆境处理下的表达模式进行了分析。脱水处理下，地上部ZmNF-YB13的表达量先下调后上调，在10 h达到峰值，与对照组相比显著上升；根中ZmNF-YB13的表达量逐渐上调，在10 h出现下调，随后在24 h时上调并达到峰值，约为对照的2.3倍（图3-A）。冷（4℃）处理下，ZmNF-YB13在地上部中表达量下调；在根中先下调后上调，在5 h时表达量最大，与对照组差异显著（图3-B）。盐处理下，地上部中的表达量在24 h时显著上调；在根中表达量迅速上调，并在24 h达到最高水平，约为对照的32倍（图3-C）。PEG处理下，ZmNF-YB13在地上部中的表达量迅速上调，随后下调，但在24 h达到最高，显著高于对照水平；在根中呈现先下调后上调的趋势，在5 h表达量显著低于对照组，在24 h时表达量最高（图3-D）。在喷施植物激素ABA后，ZmNF-YB13在叶中的表达量迅速下调，在3 h时出现上调，表达水平最高（图3-E）。在JA处理下，ZmNF-YB13在叶中的表达量缓慢上调，在5 h时达到最高水平，约为对照的2.3倍，差异显著（图3-F）。

图3 逆境和激素胁迫下ZmNF-YB13基因的表达模式分析Fig.3 Expressions of ZmNF-YB13 in response to abiotic and hormone stress in maize

2.3 ZmNF-YB13转基因拟南芥的抗逆性分析

2.3.1 ZmNF-YB13转基因植株的获得 提取具有草铵膦抗性的拟南芥植株DNA，进行PCR检测，发现在6个独立的转基因株系中检测到目的基因的存在，而野生型和阴性对照均无相应的扩增产物（图4-A）。通过qPCR检测发现，ZmNF-YB13基因在6个转基因株系中均有不同程度的表达，表达水平显著高于野生型对照植株（图4-B）。选取L-1、L-2和L-3三个株系进行后续表型观察与鉴定。

图4 T3代转基因拟南芥的鉴定Fig.4 Identification of T3 transgenic A.thaliana

2.3.2 1 /2 MS培养基中不同逆境和激素胁迫下转基因拟南芥的表型分析 由图5可知，在对照组1/2 MS培养基中，野生型和转基因拟南芥均能正常生长。在含有100 mmol/L NaCl的1/2 MS培养基中，野生型和转基因拟南芥叶片萎缩，转基因拟南芥中L-2和L-3根长与野生型拟南芥无显著差异，但L-1的根长长于野生型，差异显著（P ＜ 0.05）。在含有200 mmol/L甘露醇的1/2 MS培养基中，转基因拟南芥根长长于野生型，差异极显著（P ＜ 0.01）。在含有75 μmol/L JA的1/2 MS培养基中，野生型和转基因拟南芥侧根较少，但转基因拟南芥根长长于野生型，差异显著（P ＜ 0.05）。在含有50 μmol/L ABA的1/2 MS培养基中，野生型和转基因拟南芥叶片均发黄，但转基因拟南芥根长长于野生型，差异极显著（P ＜0.01）。以上结果说明，异源表达ZmNF-YB13使拟南芥对逆境以及激素胁迫的耐受性增强。

图5 不同胁迫处理下转ZmNF-YB13基因拟南芥的表型分析Fig.5 Phenotypic analysis of ZmNF-YB13 transgenic A.thaliana under different stress treatments

2.3.3 土壤种植条件下转基因拟南芥株系的耐旱和抗盐性分析 在正常培养条件下，野生型和转基因拟南芥生长良好，无表型差异（图6-A）。对转基因株系和野生型植株进行连续3周的干旱胁迫和一周高盐（300 mmol/L NaCl）胁迫处理，发现野生型植株叶片严重萎蔫失水，而转基因植株含有更多的绿叶（图6-B，C），表现出更健康的生长状态。干旱处理实验组，经过2 d的覆水处理后，野生型拟南芥叶片出现轻微的恢复，而过表达植株的叶片充分伸展，呈健康的状态。分别对盐和干旱处理的野生型和转基因拟南芥叶片的MDA含量和POD活性进行检测，结果（图6-D）表明，两种处理条件下，ZmNF-YB13异源表达拟南芥的MDA含量均低于野生型，差异极显著。在干旱处理下，转基因拟南芥的POD活性显著高于野生型。而在正常处理和盐处理下，POD的活性在野生型和转基因拟南芥中均无明显差异（图6-E）。

图6 土壤中高盐和干旱处理下拟南芥表型分析Fig.6 Phenotypic analysis of A.thaliana under high salt and drought treatment in soil

3 讨论

植物对高盐、干旱胁迫的响应机制是一个非常复杂的过程，转录因子在调节植物发育过程和响应环境变化中起着重要作用［26］。植物的NF-YB基因家族的不同成员参与了植物对干旱、盐等逆境胁迫的响应［27］。本研究从玉米中克隆了一个NF-YB转录因子基因ZmNF-YB13，具有NF-Y转录因子家族所特有的结构域。

目前其它物种中有许多NF-YB亚家族在响应植物胁迫中的报道。如分别过表达AtNF-YB1和AtNFYB2的拟南芥植株抗旱性和耐热性增强［28］。在干旱胁迫条件下，ZmNF-YB16的过表达提高了玉米植株在营养和生殖阶段对脱水和干旱胁迫的抗性，并提高了玉米产量［29］。异源表达野云杉PwNF-YB3基因的拟南芥植株对盐、干旱和渗透胁迫的耐受性显著增强［30］。在缺水条件下，异源表达葡萄PdNF-YB7基因的拟南芥植株表现出更强的耐旱性［31］。在菊花中过表达CmNF-YB8基因降低了植株的耐旱性。而通过RNA干扰降低CmNF-YB8基因的转录水平后，植株的抗旱性增强［32］。这些研究结果表明，不同物种中的NF-YB转录因子对不同逆境的响应存在差异。本研究发现ZmNF-YB13基因受脱水、冷、高盐、PEG胁迫的诱导表达，说明ZmNF-YB13基因能够响应非生物胁迫。为进一步明确该基因在响应玉米非生物胁迫中的作用，我们对转ZmNF-YB13基因拟南芥进行了抗逆分析。结果发现，在分别含有100 mmol/L NaCl和200 mmol/L 甘露醇的1/2 MS培养基中，转基因拟南芥根长长于野生型，差异显著。土壤中生长的转基因拟南芥，在干旱和含有300 mmol/L NaCl的高盐处理下，绿叶数量更多，差异显著。MDA是一种脂质过氧化产物，通过测量MDA的含量可以评估植株氧化应激反应［33］。结果显示，在干旱和高盐处理下转基因拟南芥中MDA含量低于野生型，差异显著。并且在干旱胁迫下，转基因拟南芥的POD活性显著高于野生型，进一步说

明了ZmNF-YB13基因参与植物的干旱和盐胁迫响应过程。

本实验研究的ZmNF-YB13基因，曾被命名为ZmNF-YB2，前人研究发现转ZmNF-YB2基因玉米可以增强玉米的抗旱性［34］。我们的研究结果显示，异源表达ZmNF-YB13基因的转基因拟南芥抗旱性增强，这和前人研究结果一致。同时我们还发现了ZmNF-YB13基因能够响应盐胁迫。通过qPCR发现ZmNF-YB13基因的表达量在JA处理下上调表达。并且在含有75 μmol/L JA的1/2 MS培养基中，异源表达ZmNF-YB13基因的拟南芥根长显著长于野生型。由此推测，ZmNF-YB13基因可能是通过JA信号通路来参与干旱和高盐的胁迫应答。

4 结论

玉米NF-Y家族基因ZmNF-YB13 cDNA全长537 bp，编码173个氨基酸。该基因在玉米多个组织器官中均有表达，其中在花丝中表达量最高，受脱水、冷、高盐、PEG逆境处理以及ABA、JA激素胁迫的诱导表达；转基因拟南芥根长在含100 mmol NaCl、200 mmol甘 露 醇、75 μmol/L JA、50 μmol/L ABA的1/2 MS培养基中与野生型有显著差异；在干旱和高盐处理下，土壤中生长的转基因植株的MDA含量降低；同时干旱处理下，转基因植株的POD活性升高，差异显著，推测ZmNF-YB13基因在玉米响应干旱和高盐胁迫中起重要作用。