HPLC法测定阿瑞匹坦中基因毒性杂质3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮

常月赏，兰公剑，王阔，陶蕾

HPLC法测定阿瑞匹坦中基因毒性杂质3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮

常月赏，兰公剑*，王阔，陶蕾

（南京正大天晴制药有限公司，江苏 南京 210046）

建立了液相色谱法测定阿瑞匹坦基因毒性杂质3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的分析方法。采用安捷伦Poroshell 120系列EC-C18柱为色谱柱，0.1%磷酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行线性梯度洗脱，流速为1.0 mL·min-1，柱温为30 ℃；检测波长为210 nm。结果表明：溶剂空白及主峰不干扰该杂质的测定；该杂质在限度浓度20%～200%的范围内线性关系良好；该杂质的回收率在99.3%～101.0%范围内，小于5.0%；对照品溶液及供试液在室温放置18 h内稳定；重复性和中间精密度均小于5.0%。本方法专属性及精密度好，准确度高，可以用于本品中基因毒性杂质3-氯甲 基-1,2,4-三唑啉-5-酮的检测。

阿瑞匹坦；基因毒性杂质；3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮；液相色谱法（HPLC）

阿瑞匹坦与其他止吐药物联合用药，适用于预防高度致吐性抗肿瘤化疗的初次和重复治疗过程中出现的急性和迟发性恶心和呕吐[1-6]。阿瑞匹坦具有全新的药理作用机制，其作为首个神经激肽-1（NK-1）受体拮抗剂为预防和治疗癌症患者化疗引起的恶心呕吐提供了更多的药物治疗选择[7-9]。

3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮是合成阿瑞匹坦的关键物料，属三唑啉酮类衍生物[10]。3-氯甲基-1,2, 4-三唑啉-5-酮为单卤代烷烃化合物[11-12]，依据ICH M7，该化合物具有基因警示结构。阿瑞匹坦为肿瘤辅助间歇用药，每日最大给药剂量为125mg，服用周期一般在1～12月内。该化合物无明确的TD50，最大允许日摄入量按20 μg来计算，其限度为160 μg·g-1。本文拟建立一种液相色谱分析方法，用于阿瑞匹坦原料药中基因毒性杂质3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的控制，以保证用药安全性。

1 实验部分

1.1 仪器

液相色谱仪，型号1260，安捷伦；电子天平，型号ME36S，赛多利斯；有机针头滤器，材质为尼龙，型号13 mm×0.22 μm，南京荣华科学器材有限公司；离心机，SIGMA型号3-18K。

1.2 试药

供试品阿瑞匹坦，批号138181001，南京正大天晴制药有限公司；杂质3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮对照品，批号YY18080202，江苏宇田医药有限公司；磷酸、甲醇、乙腈，均为色谱级。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

流动相A为0.1%磷酸溶液（取磷酸1 mL，加水1 000 mL，混匀），流动相B为乙腈。色谱柱厂家为安捷伦，型号Poroshell 120系列 EC-C18柱，内径为4.6 mm，长度为10 cm，粒径为2.7 μm。流速为1.0 mL·mim-1，柱温为30 ℃，检测波长为 210 nm。梯度洗脱程序如表1所示。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备

溶剂：0.1%磷酸溶液-甲醇（95∶5）。

对照品贮备液：精密称取3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮对照品约16 mg，置100 mL量瓶中，加适量0.1%磷酸溶液-甲醇（95∶5）溶解后定容至刻度线，摇匀，量取该贮备液1 mL，置100 mL的容量瓶中，加0.1%磷酸溶液-甲醇（95∶5）定容，摇匀。

对照品溶液：取对照品贮备液2.00 mL，置 20 mL的容量瓶中，加0.1%磷酸溶液-甲醇（95∶5）定容，摇匀。

供试液：取本品约20 mg，精密称定，置20 mL量瓶中，加甲醇1 mL使溶解，用0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，过滤。

加标供试液：取本品约20 mg，精密称定，置20 mL量瓶中，加甲醇1 mL使溶解，精密加入杂质贮备液2 mL，再用0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液。

2.3 专属性

取溶剂空白（0.1%磷酸溶液-甲醇（95∶5）、对照品溶液和供试液各20 μL进样分析。对结果进行分析，溶剂空白和主峰对3-氯甲基-1,2,4-三唑 啉-5-酮的测定无干扰，该方法专属性符合要求。

2.4 滤膜吸附考察

取加标供试液，分别进行离心（1 000 r·min-1，10 min），取上清液；用有机针头滤器（尼龙66， 13 mm×0.22 μm）分别弃去0、1、2、3、4、5 mL初滤液后，取续滤液，分别进样分析。计算弃去不同体积的滤液的峰面积与离心后峰面积的比值，考察该材质的滤头是否对3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮是否有吸附。考察结果见表2。

表2 滤膜吸附考察结果

弃去不同体积的滤液，3-氯甲基-1,2,4-三唑 啉-5-酮的峰面积与离心后峰面积的比值在98%～102%之间，表明该材质的滤头是对3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮无吸附，可以用于过滤本品供 试液。

2.5 线性与范围

取对照品贮备液，用溶剂（0.1%磷酸溶液-甲醇（95∶5）定量稀释制成相当于限度（160 mg·L-1）浓度的20%、50%、80%、100%、150%与200%系列浓度的线性溶液，依次取各溶液20 μL进样分析。以质量浓度为纵坐标，以杂质的峰面积为横坐标，做散点图，并进行线性拟合分析。线性方程为=2.942 3×10-2+1.838 8×10-3，线性相关系数为1.000 0，表明3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮在 32～320 mg·L-1范围内，浓度与峰面积的线性关系好。

2.6 LOQ与LOD

参考对照品溶液中主峰的信噪比，取对照品溶液适量，稀释后进样分析，当溶液中主峰的信噪比/≥10时，该溶液作为定量限（LOQ）溶液；再取定量限溶液稀释后进样分析，按信噪比/≥3作检测限（LOD）溶液。取定量限溶液，连续进样6次。3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的定量限为 0.66 ng，检测限为0.20 ng。定量限溶液连续进样6针，峰面积小于10.0%，保留时间小于2.0%。该方法检测灵敏度良好。

2.7 准确度

取本品约20 mg，精密称定，置20 mL量瓶中，加甲醇1 mL使溶解，精密加入杂质贮备液1 mL（限度浓度的50%）或2 mL（限度浓度）或3 mL（限度浓度的150%），再用0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液。每个限度浓度各平行配制3份。按外标法以峰面积计算回收率。3-氯甲 基-1,2,4-三唑啉-5-酮在3个浓度点的回收率在99.3%～101.1%之间，（=9）小于5.0%，回收率及回收率的值均符合要求。

2.8 重复性

照准确度项下配制6份限度浓度的加标供试液，各取20 μL进样分析，记录色谱图。按外标法计算加标供试液中3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的含量，均值为0.017%，为3.3%。该方法重复性符合验证要求。

2.9 中间精密度

不同的实验人员于不同日期，使用不同的仪器，重新配制6份加标供试液，测定加标供试液中3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的含量。此次测定的6次结果与重复性6次结果共12次，测量结果的均值为0.016%，为4.5%。该方法中间精密度符合验证要求。

2.10 进样精密度

取对照品溶液连续进样6针，3-氯甲基-1,2, 4-三唑啉-5-酮峰面积的为0.6%，保留时间为0.1%，表明仪器的进样精密度符合要求。

2.11 溶液稳定性

取对照品溶液和供试液，在室温条件下放置0、2、6、12、18 h后，分别进样。对照品溶液在室温放置18 h，3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮峰面积与0 h峰面积的比值在90%～110%之间；供试液中未检出该杂质，且无其他杂质峰干扰。对照品溶液和供试液至少在室温18 h内稳定。

2.12 耐用性

适当调整流速、柱温、磷酸浓度等参数，对照品溶液中，3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮峰理论板数均大于5 000，拖尾因子在0.8～1.2范围内；供试液中均未检出该杂质；加样供试液中该杂质的含量相差不大。该方法耐用性良好。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

采用PDA检测器进行全波长扫描，结果显示，3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的最大吸收为215.9 nm，故采用210 nm波长作为检测波长。

3.2 供试液浓度的确定

3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮质量浓度为 0.16 μg·mL-1时响应值的/约为112，以此作为限度质量浓度，则供试液质量浓度为1.023 mg·mL-1。最终确定供试品质量浓度为1 mg·mL-1。

3.3 供试液配制方法的选择

3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮为强极性化合物，为避免其在反相色谱系统中分析时产生溶剂效应，选用的溶剂应含有高比例的水相（0.1%磷酸-甲醇（95∶5）），而阿瑞匹坦为弱极性化合物，在水中几乎不溶。因此溶剂0.1%磷酸-甲醇（95∶5）不能使阿瑞匹坦溶解成1 mg·mL-1的溶液，3-氯甲基-1,2, 4-三唑啉-5-酮在甲醇和水中溶解度良好。故先使用尽可能少的甲醇使供试品和其中可能存在的3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮溶解，再使用0.1%磷酸稀释定容至刻度，供试品析出，而可能存在的3-氯甲基-1, 2,4-三唑啉-5-酮依然在溶液中，过滤，取续滤液作为供试液。

4 结 论

本研究对3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的检测方法进行了详细方法学验证，该方法专属性、灵敏度、准确度、精密度、耐用性良好，可用于阿瑞匹坦中3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的检测，为合格的阿瑞匹坦的生产提供了有效的质控方法。

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Determination of Genotoxic Impurity 3-Chloromethyl-1,2,4-triazolin-5-one in Aprepitant by HPLC

,,,

（Nanjing ChiaTai Tianqing Pharmaceutical Co., Ltd., Nanjing Jiangsu 210046, China）

A HPLC method for the determination of 3-chloromethyl-1,2,4-triazolin-5-one, a genotoxic impurity of aprepitant was established. Agilent poroshell 120 series EC-C18 column was used as chromatographic column.Linear gradient elution was carried out with 0.1% phosphoric acid solution as mobile phase A and acetonitrile as mobile phase B.The flow rate was 1.0mL·min-1.The column temperature was 30℃.The detection wavelength was 210nm. The results showed that the solvent and the main peak did not interfere with the determination of the impurity.The linearity of the impurity was good in the range of 20%～200% of the limit concentration.The recovery of this impurity was in the range of 99.3% ～ 101.0%, and thewas less than 5.0%.The solution were stable within 18h at room temperature.Thes of repeatability and precision were less than 5.0%. This method has good specificity, precision and accuracy, and can be used for the detection of genotoxic impurity 3-chloromethyl-1,2,4-triazolin-5-one in this product.

Aprepitant; Genotoxic impurity; 3-Chloromethyl-1,2,4-triazolin-5-one; Liquid chromatography (HPLC)

TQ460.7

A

1004-0935（2023）09-1399-04

2022-09-12

常月赏（1993-），女，河北省衡水市人，硕士，2019年毕业于中国药科大学药物化学专业，研究方向：药物分析。

兰公剑（1981-），男，工程师，硕士，研究方向：药物分析。