牛蒡多糖的保湿性研究 *

陈希瑞 张超杰 张 伟 陈靠山

（1.山东大学生命科学院，山东 济南 250100；2.山东博德医药研究院有限公司，山东 德州 253084）

牛蒡（Arctium lappaL.），作为菊科牛蒡属直根系二年生大型草本植物，根鲜嫩多汁、营养丰富［1］；既是食材，也被作为中药用于治疗疾病［2］。牛蒡菊糖灌胃可使酒精损伤小鼠的肝脏质量、肝指数显著降低［3］；牛蒡根中水溶性膳食纤维菊糖、绿原酸等组分也具有较强的抗氧化活性［4］；相关研究［5］表明，以果蝇为动物模型进行的动物生存实验，牛蒡根可以在一定程度上延缓衰老；牛蒡叶多糖通过清除DPPH 自由基，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有较明显的抑制作用［6］。由此可见，无论从细胞水平还是动物水平，从牛蒡根部获得的化合物都有很重要的研究价值。

多糖由单糖以糖苷键连接而成［7］。人类皮肤中的黏多糖主要包括透明质酸（HA）、硫酸软骨素和肝素等。其中大部分多糖通过发挥各自的生物学功能来影响细胞的生命活动，如机体免疫能力的提高，机体抗衰老能力的提高，抵抗肿瘤、病毒能力的改善和凝血功能的改善等［8］。另外，由于多糖本身的化学结构为多羟基，从而使得多糖具备很强的吸水性、乳化性、高黏度等特性，并且这些特性正是化妆品保湿原料所需要的。随着大众消费观念的改善，普众对护肤的层次要求越来越高，因此就要求化妆品的品质有相应的提高，所以具备天然、有效、安全特性的护肤品越来越受到大众的瞩目。因此，从动植物中提取天然组分，作为保湿剂应用于化妆品，成为保湿化妆品的发展趋势。本研究中的牛蒡根低聚菊糖，根据前期郝林华等［9］的研究成果表明是由糖苷键相连，由葡萄糖和果糖链接形成的聚合度为13的低聚果糖。作为天然多糖，牛蒡多糖易溶于水、无毒副作用，广泛应用于化妆品、食品、生物医用材料等健康领域。本文主要研究牛蒡多糖的保湿效果及相关的作用机制，为其在化妆品领域的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料SPF 级健康SD 大鼠，雌雄各半，体质量（170±10）g，许可证号：SCK（鲁）2017-003；普通豚鼠，雌雄各半，体质量（200±30）g，合格证编号：SCXK（鲁）-2017-0010；KC 人表皮细胞、KC Growth 培养基、人透明质酸ELISA试剂盒（广东博溪生物科技有限公司）；胶原蛋白1试剂盒、水通道蛋白3（AQP3）试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；2，4-二硝基氯苯、HA、透明质酸酶（HAase）、对二甲氨基苯甲酸、乙酰丙酮、醋酸缓冲液［福晨（天津）化学试剂有限公司］；MULTISKAN GO型酶标仪（美国Thermo 公司）、CO2培养箱［日本三洋（SANYO）公司］、超净工作台［苏洁医疗器械（苏州）有限公司］、倒置显微镜［尼康仪器（上海）有限公司］。

1.2 研究方法

1.2.1 牛蒡多糖的制备参照郝林华等［9］的制备方法，获得牛蒡多糖。

1.2.2 牛蒡多糖对豚鼠皮肤致敏性研究豚鼠适应性培养7 d 后，随机分为3 组，每组12 只，雌雄各半，分别为空白对照组（无菌水）、阳性对照组（质量分数1%的2，4-二硝基氯苯）、牛蒡多糖组（1%牛蒡多糖）。实验前24 h，豚鼠背部脊柱2 侧的毛去掉，不能损伤皮肤，去毛范围左右各1.5 cm×1.5 cm，取受试药物0.5 g，直接涂抹在1 cm×1 cm大小的1侧皮肤上，样品不得损失。另外一侧作为空白对照，每天1次，连续涂抹14 d。从第2天开始，每次涂抹前剪毛，用水清除残留受试药物，1 h后观察并记录涂抹部位有无红斑和水肿等情况，并按照《化妆品安全技术规范（2015 年版）》［10］中的“皮肤刺激反应评分”表进行评分。见表1。

表1 皮肤刺激反应评分表

1.2.3 牛蒡多糖对大鼠皮肤HA含量的影响实验分别设置空白对照组KC Growth培养液接种细胞（BC）、阴性对照组0.2%十二烷基硫酸钠（SLS）+KC Growth 培养液接种细胞（NC）、阳性对照组0.2%SLS+PPARα激活剂（WY14625）+KC Growth 培养液接种细胞、实验组0.2%SLS+牛蒡多糖液（1.5%）接种细胞。收集对数生长期细胞，按照细胞密度1×104个/孔接种至96孔板，于37 ℃、5%CO2培养箱进行培养。培养结束后收集细胞离心取上清液，用于HA 检测，具体实验操作参照试剂盒说明书。

1.2.4 牛蒡多糖对大鼠皮肤水含量影响实验将适应性培养7 d 的SD 大鼠随机分为空白组、对照组（HA 组）、实验组（牛蒡多糖组）3 组，每组12 只，雌雄各半。实验前24 h，去掉大鼠背部脊柱两侧的毛，不能损伤皮肤，去毛范围左右各1.5 cm×1.5 cm，取受试药物0.5 g，直接涂抹在1 cm×1 cm 大小的一侧皮肤上，样品不得损失。另外一侧作为空白对照，每天1 次，连续涂抹14 d。空白组无菌水清洁背部两侧的无毛区域，约为1 cm×1 cm，清洗干净后不做任何处理；对照组用等剂量浓度的HA样品溶液，实验组给予等剂量浓度牛蒡多糖样品溶液。每天涂抹1 次，连续涂抹7 d；涂抹完成后麻醉大鼠并且对实验皮肤进行取材。单一的一侧皮肤保存于液氮中，以备AQP3、胶原蛋白1的测定；另外一侧的皮肤清除脂肪称重，然后平展于载玻片上，温度设置80 ℃，烘箱中干燥。干燥12 h后称重。皮肤含水量=（湿重-干重）/湿重×100%。

1.3 统计学方法应用SPSS 10.0 软件进行分析，测定数据以（±s）表示，行t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 牛蒡多糖对豚鼠皮肤致敏性研究本实验中2，4-二硝基氯代苯作为阳性对照，表现出强烈的致敏性；而空白对照组及牛蒡多糖组的豚鼠在整个实验过程中皮肤于肉眼观察不到明显变化，像痘印、红斑、水肿等不良反应均未出现；同时，豚鼠呼吸平稳、四肢有力，对其他豚鼠未表现出攻击性。因此，我们得出结论牛蒡多糖对豚鼠皮肤无刺激性，致敏性为零，未见到明显的皮肤变态反应。见表2。

表2 3组豚鼠皮肤过敏性评价实验结果（分）

2.2 牛蒡多糖对大鼠皮肤HA 含量的影响实验以标准溶液的浓度为纵坐标，OD 值（OD450）为横坐标，得出标准曲线y=-349.15x+446.53（R2=0.9743）。根据样本的OD450值，可以在标准曲线上计算出样品的浓度，根据稀释倍数，得出样品实际浓度。由此细胞实验我们得出牛蒡多糖液在一定浓度范围时可以促进人角质形成HA。而HA 作为一种酸性黏多糖，是肌肤水嫩的重要基础物质，具有特殊的保水作用，是最为理想的天然保湿因子。所以，我们得出结论牛蒡多糖也可以通过提高皮肤HA的含量来维持皮肤含水量。见表3。

表3 牛蒡多糖对3组大鼠皮肤HA含量的影响实验（±s，μg/g）

表3 牛蒡多糖对3组大鼠皮肤HA含量的影响实验（±s，μg/g）

HA含量142.13±3.12 205.29±5.341）179.78±2.961）组别空白组对照组实验组鼠数12 12 12

2.3 牛蒡多糖对大鼠皮肤的保湿性实验作为一种快速跨膜转运水、甘油和尿素等小分子的膜整合蛋白，水通道蛋白在皮肤屏障功能、保持皮肤水分中扮演重要角色。AQP3 作为人体皮肤中含量最高的水通道蛋白亚型，主要位于细胞的胞浆膜上。胶原蛋白作为皮肤组织的主要蛋白之一，对维持皮肤弹性起到重要作用。从实验结果中可以发现，与空白组相比，HA 组与牛蒡多糖组皮肤的含水量相对较高。与空白组相比，HA 组和牛蒡多糖组对AQP3 的表达起到负调控的作用，可以降低AQP3在皮肤中的表达。另外，牛蒡多糖组可以提高皮肤胶原蛋白的含量，HA 组的皮肤胶原蛋白1 的含量次之。因此，牛蒡多糖拥有良好的保湿效果，具有较好的保湿化妆品开发潜力。见表4。

表4 3组大鼠皮肤含水量、AQP3及胶原蛋白1含量（±s）

表4 3组大鼠皮肤含水量、AQP3及胶原蛋白1含量（±s）

组别空白组对照组实验组胶原蛋白1/（ng/mL）1021.29±121.12 1123.51±116.591）1249.89±123.461）鼠数12 12 12皮肤水含水量/%0.55±0.02 0.62±0.011）0.63±0.021）AQP3/（ng/mL）0.31±0.02 0.24±0.021）0.23±0.011）

3 讨论

随着年龄增长，人体逐渐衰老，皮肤的保湿结构不可避免地受到一定程度的损伤，导致皮肤组织细胞和细胞间的含水量减少。而水分的丢失导致胶原蛋白硬化［11］，当皮肤的角质层水分丢失到一定程度时，就会导致皮肤干燥、失去弹性、皱纹增加，从而加快皮肤老化的速度。所以，水分在维持皮肤健康中起着至关重要的作用，因此，护肤化妆品所使用的保湿剂是广大化妆品研发人员最关注的课题。作为亲水性物质，保湿剂分子中都含有大量的亲水基团，如羟基和羧基等，而甘油、木糖醇、山梨醇等化合物正是因为这种化学结构成为常用的保湿原料。这类化合物通过自身的结构羟基与水分子结合，从而使皮肤保持一定的湿度来延缓水分的散失［12］。另外，众多的研究［13，14］表明牛蒡根水提物可以提高大鼠肝脏和血清中的SOD 活性，提高细胞的抗氧化能力。由此可以得出结论，天然提取的多糖作为自然保湿剂，由于自身化学结构多羟基及其他可同水形成氢键的极性基团的优势，可以使自身形成三维网状结构，来减缓水分子的流失。

本实验通过对牛蒡多糖溶液的失水率及对大鼠皮肤水含量影响的测定，确定了牛蒡多糖具有一定的保湿能力，并且随其浓度的升高，保湿能力越强。实验表明，牛蒡多糖不仅具有较好的皮肤保湿性，并且在一定浓度范围内可以提高皮肤HA 和胶原蛋白的含量，可以改善实验动物皮肤的含水量，并且无致敏性，可以作为一种天然安全的化妆品原料。