高效液相色谱法指纹图谱结合化学模式识别对除湿丸质量控制研究

杨 薇 龚 韬 宋京美 王 夏 胡银燕 严文利 周德勇孙丽蕴

1.首都医科大学附属北京中医医院北京市中医药研究所，北京 100035；2.首都医科大学附属北京中医医院皮肤科，北京 100010

除湿丸为首都医科大学附属北京中医医院院内制剂，由地黄、白鲜皮、茜草等中药组成，具有清热凉血，祛湿解毒的功效[1-4]。口服，6 g/次，2 次/d。其所含的黄芩苷、黄芩素、栀子苷、连翘酯苷A 等都具有抗炎抑菌作用[5-13]。原质量标准仅收载了显微及薄层色谱鉴别，无法全面反映复方制剂内在质量。中药高效液相色谱法指纹图谱具有专属性高、整体性强等特点，能够弥补单一化学成分质量控制的弊端，从而对其进行质量控制[14-20]。

1 仪器与材料

1.1 仪器

SHIMADZU SPD-M20A 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；XP105DR 电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司；双量程：31/120 g，精度0.01/0.1 mg）；KX-2127QT超声波清洗机（北京科玺世纪科技有限公司）；ELGA LabWater 水纯化系统（法国威立雅水务集团）。

1.2 药品与试剂

1.2.1 对照品 连翘酯苷A（批号：111810-201707）、黄芩苷（批号：110715-201821）、丹皮酚（批号：110708-201407）、汉黄芩苷（批号：112002-201501）、大叶茜草素（批号：110884-200604）、汉黄芩素（批号：111514-201706）对照品购自中国食品药品检定研究院；栀子苷（批号：110749-200410）、羟基茜草素（批号：111898-201101）对照品购自中国药品生物制品检定所。

1.2.2 样品 所用饮片及29 批除湿丸样品均由首都医科大学附属北京中医医院提供，除湿丸样品批号见表1。

表1 29 批除湿丸样品批号

1.2.3 试剂 甲醇（分析纯，北京市通广精细化工品公司）；乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司）；磷酸（色谱纯，天津市光复科技发展有限公司）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Luna Omega Polar C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脱：0%～5 min，99%B；5～70 min，99→65%B；70～90 min，65%→45%B；90～110 min，45%→10%B；110～120 min，10%B；120～130 min，10%→99%B；130～140 min，99%B；流速1.0 ml/min；柱温30 ℃；检测波长254 nm；进样量10 μl。

2.2 溶液的制备

精密称定除湿丸（批号：2007007）粉末0.25 g，置50 ml 具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇15 ml，称定重量，超声处理（功率250 W，频率30 kHz）30 min，取出，放冷，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度实验 取“2.2”项下供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件下进样6 针，以23 号黄芩素为参照峰（S），计算共有峰的相对保留时间和相对保留面积RSD ≤4.60%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性实验 取“2.2”项下供试品溶液，分别于0、4、8、12、24 h 进样，以23 号黄芩素为参照峰（S），计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD≤4.56%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.3.3 重复性实验 取同一批样品（批号：2007007）6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。以23 号黄芩素为参照峰（S），计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD≤3.61%，表明该方法重复性良好。

2.4 高效液相色谱法指纹图谱建立及相似度评价

将29 批除湿丸样品按“2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件进行色谱分析。将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，共确定了35 个共有峰（图1）。29 批除湿丸样品（S1～S29）高效液相色谱法指纹图谱见图2，S1-S29 对应批号见表1。29 批除湿丸样品的指纹图谱相似度均≥0.973，表明不同批次除湿丸中主要物质群差异性小，制备工艺较稳定，形成的对照图谱能够作为衡量除湿丸制剂的标准参照物，结果见表2。

表2 29 批除湿丸样品的相似度

图1 除湿丸共有模式

图2 29 批除湿丸样品的高效液相色谱指纹图谱

图3 单味饮片及除湿丸物质基准相关性色谱图

2.5 除湿丸共有峰的归属研究及化学计量统计分析

2.5.1 共有峰的归属研究 按照“2.2”项下方法分别制备各单味药材供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行分析，对除湿丸指纹图谱进行色谱峰归属。结果显示，除湿丸指纹图谱的35 个共有峰中9、10、12、13、16、18、19、20、22、26、31、33 号峰峰来自茜草；7、10、14、15、17、18、23、25、26、27 号峰来自黄芩；2、3、4、10、11、18 号峰来自牡丹皮，18、30～35 号峰来自茯苓皮；4、5、13、18 号峰来自炒栀子；8、28、29 号峰来自连翘；18、24 号峰来自威灵仙：18、28、32 号峰来自紫草；28 号峰来自当归：18 号峰来自猪苓，结果见图3。

2.5.2 主要色谱峰的指认在标定的35 个色谱峰中指认出8 个色谱峰，其中5 号峰为栀子苷，8 号峰为连翘酯苷A，15 号峰为黄芩苷，17 号峰为汉黄芩苷，18号峰为丹皮酚，23号峰为黄芩素，25 号峰为汉黄芩素，26 号峰为羟基茜草素，33 号峰为大叶茜草素（图4）。并选定23 号峰为参照峰。

图4 混合对照品色谱图

2.5.3 聚类分析 将29 批除湿丸样品35 个共有峰的相对峰面积输入SPSS 22.0 软件，对样品进行系统聚类，采用组建连接法，以欧式距离为分类依据。当欧氏距离＞15 时，29 批样品聚为3 类，其中S1～S16 聚为一类、S17～S26 聚为一类、S27～S29 聚为一类，见图5。由聚类分析结果可以看出，除湿丸整体质量较为稳定，但不同批次除湿丸间存在差异，并与生产日期有明显相关性。

图5 29 批除湿丸聚类分析树状图

2.5.4 主成分分析 为进一步比较不同批次除湿丸质量差异，将指纹图谱中所得的35 个共有峰的相对峰面积导入SPSS 22.0 软件中进行主成分分析，共7 个成分特征值＞1，具体数值分别为13.745、5.447、5.037、3.005、2.077、1.580、1.197，是影响除湿丸质量评价的主要因子；7 个主成分因子的累计方差贡献率为89.133%，结果见表3。提示新变量综合信息能力强，可以在损失较少信息的前提下，减少变量，达到降维目的。旋转成分矩阵分析结果表明，第一主成分主要反映色谱峰6、7、10、21、23～27、35 的信息；第二主成分主要反映色谱峰5、7、8、14、15、17、24 的信息；第三主成分主要反映色谱峰1、4、9、11、12、14、19 的信息；第四主成分主要反映色谱峰19、20、22、28、33 的信息；第五主成分主要反映色谱峰30、32、34 的信息；第六主成分主要反映色谱峰31 的信息；第七主成分主要反映色谱峰13、18 的信息。

表3 特征值和累积贡献率

3 讨论

共有峰归属研究中发现除湿丸制剂中黄芩苷与黄芩素在黄芩饮片中占比不同。黄芩苷作为黄芩中主要的有效成分，其含量对药效具有重要意义[21-23]。为防止黄芩素被水解，饮片加工厂通常会进行杀酶保苷，对黄芩杀酶保苷不彻底、硫熏等均会导致黄芩素的水解[24-27]。聚类分析结果可以明显看出不同批次除湿丸样品的分类与生产时间的相关性有密切关系，表明除湿丸的化学成分随着储存时间的长短在整体变化，需对其贮存的时间、温度、湿度等条件进行进一步研究。指纹图谱结合聚类分析、主成分分析等方法可全面评价除湿丸的质量，为除湿丸质量控制提供参考依据。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。