紫杉醇对食蟹猴和人CYP1A2、CYP3A4及CYP2A6酶代谢的影响

耿祥飞，张广州，任 娟，王立娜，贾丽娟，沈国林，刘鸿君

（1.中国医学科学院医学实验动物研究所，北京 100021；2.军事医学科学院实验动物中心，北京 100071；3.中国人民解放军第二炮兵总医院，北京 100088；4.北京汇智泰康医药技术有限公司，北京 101111）

药物相互作用是两种或两种以上药物联合使用时有时可能会对疗效产生一定的影响，也可能产生不良反应。随着中药在世界范围内的应用，中药与西药联合应用的情况越来越多。然而人们对中药与西药联合应用的后果了解很少，这在一定程度上增加了中药与西药联合用药的风险。细胞色素CYP450酶在药物代谢中起着重要的作用，是产生药物相互作用最重要的途径之一。CYP1A2酶在肝组织中有特异性表达［1］，是重要的细胞CYP450酶之一，约占肝脏总的CYP450氧化酶含量的13％，而且CYP1A2酶参与许多前致癌物和前毒物的代谢活化，从而诱发基因突变或抑制一些基因的表达，造成细胞损害或诱导凋亡，甚至发生肿瘤。CYP2A6是CYP2A亚家族重要成员之一，约占整个CYP450酶系统的5％，对很多药物和环境中化合物的清除起重要作用，参与许多药物代谢，还可激活许多结构上非相关的前致癌物［2］，比如它能将许多致癌原如黄曲酶毒素B1、烟草中大量的亚硝胺致癌原激活为强致癌物，N-亚硝基二甲胺激活为强致癌物则与肺癌罹患率显著相关［3，4］。CYP3A酶是其中最重要的，其含量占人肝CYP的30％［5］，参与了临床上约50％药物的代谢［6］，对CYP3A活性的影响将导致临床上出现严重的药物相互作用［7］。非那西汀、香豆素和睾丸酮是特异性的CYP1A2、CYP2A6和CYP3A4酶的底物，通过建立相应的HPLC检测方法，可以准确测定三种底物相应代谢产物的产量，为研究紫杉醇对CYP1A2、CYP3A4和CYP2A6酶活性的影响提供一定的基础。

食蟹猴在形态学、生殖生理特性和生化代谢方面与人类非常相似，在遗传物质上也与人类有98％左右的同源性，因此，应用食蟹猴进行研究的结果最容易推广于人类，早已被作为医学和生物学各领域研究的理想实验动物。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：6-磷酸葡萄糖（Sigma公司）、氧化型辅酶Ⅱ（北京纵横洋洲公司），6β羟基睾丸酮（Sigma公司），6-磷酸葡萄糖脱氢酶（北京纵横洋洲公司），睾丸酮，非那西丁，香豆素（Sigma公司），甲醇、乙腈（色谱纯）均购自天津四友试剂公司，高纯水，肝微粒体（汇智泰康公司）。

1.1.2 仪器：Agilent高效液相色谱、Sigma高速离心机（Sigma公司）、MDF-U50V超低温冰箱（-80℃）、超净工作台、全自动高压锅（日本三洋公司）、微型旋涡混合仪QL-901（江苏海门市麒麟医用仪器厂）、电热恒温水浴箱BHW-2（北京医疗设备厂）、移液枪、量筒、烧杯、SHZШ型水循环真空泵（上海亚荣生化仪器厂）、抽滤器（北京八方公司）。

1.1.3 实验动物：来自军事医学科学院实验动物中心人工饲养的食蟹猴［SCXK-（军）2007-004］，常规饲养观察无异常表现，心、肝、肾等重要器官血液生化指标检测正常。

1.2 方法

1.2.1 肝微粒体混合酶系配制：肝微粒体0.5mg/mL，3.3mmol/L MgCl2，3.3mmol/L 6-磷酸葡萄糖，1.3mmol/L氧化型辅酶Ⅱ，6-磷酸葡萄糖脱氢酶（0.4μ/mL），0.1mol/L磷酸钾缓冲液（pH=7.4）定容到250mL，混合酶系配制均在冰浴上进行。

1.2.2 供试品配制：精密称取紫杉醇341.6mg，用10mL乙睛超声溶解，加入到孵育系统的终浓度为400μmol/L，配制成7个浓度400μmol/L、200μmol/L、100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L。

1.2.3 睾丸酮、非那西丁和香豆素体外代谢方法：体外代谢的孵育体系按照（1.2.1）配制，每管0.25mL孵育体系中加入200μmol/L底物2.5μL，同时加入不同浓度的紫杉醇，在对照组中加入溶媒以消除实验误差，加完之后轻微混匀，每水平平行3个管，将反应管放入37℃恒温水浴中孵育。

1.2.4 样品处理方法：将反应管放入37℃恒温水浴中孵育30min后，取出加入0.25mL冰冷乙腈终止反应，放入4℃冰箱保存1h使蛋白沉淀，3000r/min离心10min，然后加入到内衬管中10000r/min离心5min，10μL进样于HPLC中进行测定。

1.2.5 代谢产物的检测：色谱条件，扑热息痛：色谱柱Agilent（LC-18 5μm，4.6mm×150mm）（北京汇德易公司），流动相：流动相A：100％（0.1％醋酸）水，流动相B：100％甲醇，梯度洗脱：0min：90％A和10％B，6min：80％A和20％B，6.1min：100％B，8min：100％B，8.1min：90％A和10％B，最终时间13min。流速1mL/min，柱温30℃，波长245nm；7-羟基香豆素：色谱柱Agilent（LC-18 5μm，4.6mm×150mm）（北京汇德易公司），流动相：流动相A：100％（1％醋酸）水，流动相B：100％甲醇，等度洗脱，A∶B=35∶65，最终时间13min。流速1mL/min，柱温30℃，波长320nm；6β羟基睾丸酮：色谱柱Agilent（LC-18 5μm，4.6mm×150mm）（北京汇德易公司），流动相：流动相A：100％水，流动相B：100％甲醇，梯度洗脱：0min：48％A和52％B，8min：38％A和62％B，10min：100％B，10.1min：48％A和52％B，最终时间15min。流速1mL/min，柱温30℃，波长254nm。

1.2.6 计算方法：Km和Vmax计算，根据Lineweaver Burk方程［8］1/v=Km/Vmax×1/［s］+1/Vmax，v为反应速度，通过代谢产物量与代谢时间和蛋白浓度的比值求得，s为底物浓度，Km为最大反应速度一半时的底物浓度，Vmax为最大反应速度，用1/v对1/s线性回归，通过EXCEL作图即可得到一条直线方程，斜率为Km/Vmax，截距为1/Vmax；IC50计算［9］，通过与中药成分共同孵育可以得到相应的代谢产量，与未加中药成分的对照组比较，可以得到相应的相对代谢率，也可以求得相应的相对抑制率，通过中药成分各浓度与代谢抑制百分率进行线性回归可以求得IC50值，若IC50＞50μmol/L，说明药物对该CYP450抑制能力弱，IC50＜1μmol/L，说明药物对该CYP450抑制能力强，有必要获得抑制常数Ki。

2 结果

2.1 紫杉醇对食蟹猴CYP1A2、3A4和2A6酶代谢活性的影响

紫杉醇对食蟹猴CYP1A2、CYP3A4和CYP2A6酶代谢活性有一定的抑制作用，IC50值分别为570±5.9μmol/L、140±2.9μmol/L和没有影响无法计算，说明紫杉醇对不同CYP450酶的抑制作用都较弱，对CYP2A6酶活性几乎没有影响（表1）。

表1 紫杉醇对食蟹猴CYP1A2、CYP3A4和CYP2A6酶代谢活性的影响（n=3）Tab.1 The effect of paclitaxel on Cynomolgus monkey CYP1A2、CYP3A4 and CYP2A6 metabolic activity of enzymes（n=3）

表2 紫杉醇对人CYP1A2、CYP3A4和CYP2A6酶代谢活性的影响（n=3）Tab.2 The effect of paclitaxel on human CYP1A2、CYP3A4 and CYP2A6 metabolic activity of enzymes（n=3）

2.2 紫杉醇对人CYP1A2、CYP3A4和CYP2A6酶代谢活性的影响

紫杉醇对人CYP1A2、CYP3A4和CYP2A6酶代谢活性有一定的抑制作用，IC50值分别为193±6.6μmol/L、253±3.6μmol/L和24±1.6μmol/L，说明紫杉醇对不同CYP450酶的抑制作用有较大差异，对CYP2A6酶的抑制作用较强，对CYP1A2和CYP3A4酶活性的影响也较弱（表2）。

3 结论

紫杉醇是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物，也是目前所了解的惟一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。同位素示踪表明，紫杉醇只结合到聚合的微管上，不与未聚合的微管蛋白二聚体反应。细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能，特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期，阻断了细胞的正常分裂。通过Ⅱ-Ⅲ临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。紫杉醇是一种具有可开发前景的抗癌药物，所以对其在临床上使用是否有可能产生药物相互作用非常重要，有助于评价紫杉醇的安全性，指导临床合理联合用药。本实验通过以非那西丁、睾丸酮和香豆素为探针药物研究紫杉醇对食蟹猴和人肝微粒体CYP1A2、CYP2A6和CYP3A4三种酶代谢的影响。了解紫杉醇对CYP450酶系的诱导或抑制作用，有助于指导临床合理用药。本文结果认为紫杉醇对不同种属肝微粒体CYP1A2、CYP2A6和CYP3A4三种酶的活性没有较强的抑制作用，对人肝微粒体CYP2A6酶活性具有一定强度的抑制作用而对其他两种无较强的抑制作用，说明紫杉醇与上述酶作为底物的药物联合用药产生药物相互作用的几率很小，可以进一步证明紫杉醇作为一种抗癌发展潜力较大的药物在临床使用的安全性。

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