软骨微粒脱细胞基质和纤维蛋白凝胶支架皮下构建组织工程软骨

聂芳菲 潘柏林 李健宁

软骨微粒脱细胞基质和纤维蛋白凝胶支架皮下构建组织工程软骨

聂芳菲 潘柏林 李健宁

目的观察皮下植入异体软骨细胞复合异种软骨微粒脱细胞基质（Cartilage microparticle acellular matrix，CMACM）和纤维蛋白胶（Fibrin glue，FG）为支架形成组织工程软骨的可能性。方法制备猪耳廓CMACM，体外培养成年兔的耳软骨细胞，将不同的混合物植入5只成年兔背部皮下。A组：异体软骨细胞复合CMACM和FG；B组：自体软骨细胞复合CMACM和FG；C组：CMACM和FG。将每只兔子背部皮肤均分为6个区，分别植入不同混合物各两个点，以备两次取材。观察并记录皮下植入体的形态变化，分别于植入后8周和12周取材，行组织学检测。结果A组和C组未能形成软骨样组织。B组8周可以形成软骨样组织，周围炎症细胞数量较多；12周时形成的软骨组织成分单一，周围没有炎症反应，类似于正常软骨，且新生的软骨组织中均长有许多小血管，新生软骨的厚度不超过1 mm。结论将同种异体软骨细胞复合CMACM和FG植入皮下，不能形成软骨样组织；而以自体软骨细胞为种子细胞则可以得到软骨样组织，但新生软骨的体积和厚度有限，并且新生的软骨组织中长有许多小血管，可能更有利于新生软骨组织的长期存活。

异体软骨细胞软骨微粒脱细胞基质组织工程

脱细胞基质（Acellular matrix，ACM）是指异体组织经过细胞灭活处理后，制备成无活体细胞存在的ECM成分和结构。因其无抗原性且具备良好的生物相容性，使之成为组织工程支架材料的选择之一。软骨微粒脱细胞基质（Cartilage microparticle acellular matrix，CMACM）是一种新型的支架材料，与普通的软骨ACM相比，其总表面积大大增加，且微粒表面粗糙，有效提高了细胞的黏附率，解决了细胞只能在ACM表面生长的局限性。实验研究表明，将自体软骨细胞与异体CMACM和纤维蛋白凝胶（Fibrin glue，FG）结合，回植于小型猪皮下，8周后培养出的组织工程化软骨组织细胞生长良好，具有分泌软骨基质的功能[1]。由于皮下移植在耳廓重建及鼻整容手术中的应用价值，本研究拟进一步观察了兔皮下植入异体软骨细胞复合猪CMACM和FG形成软骨组织的可能性。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂和仪器

纯品系新西兰大白兔5只，体重2.5～3 kg，成年，雌雄不限（北京大学第三医院动物实验中心）。氯化钾分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；1∶250胰蛋白酶（Amresco公司，美国）；乙二胺四乙酸（北京鼎国生物技术有限责任公司）；Ⅱ型胶原酶（Invitrogen公司，美国）；DMEM/F12联合培养基（Gibco公司，美国）；胎牛血清（Hyclone公司，美国）；天绣医用生物蛋白胶（广州倍绣生物技术有限公司）。组织粉碎机（珠海北美电器有限公司）；冷冻干燥机（Yamato，日本）；CO2培养箱（Forma Scientific公司，美国）；倒置显微镜（Olympus公司，日本）。

1.2 制备CMACM

以猪耳廓软骨为原料，按照文献[1]方法制备。

1.3 体外培养兔耳软骨细胞

在无菌条件下切取实验兔一侧耳软骨，生理盐水冲洗干净，将软骨组织剪碎成悬液状；1 000 r/min离心5 min，吸除多余的液体，加入2～3倍体积的0.3%Ⅱ型胶原酶溶液；37℃恒温振荡器中振荡3 h。1 000 r/min离心5 min，吸除上层消化液，用PBS吹打稀释，150目不锈钢滤网过滤，收集滤液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基制成细胞悬液，接种于75 cm2培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱中培养，约7～10 d后按1∶4的比例传代；传代后生长迅速，约2～3 d后按1∶4的比例再次传代；约2～3 d后细胞再次长满瓶底，收集第2代软骨细胞用于回植。

1.4 软骨细胞复合CMACM和FG混合物的制备

皮下植入前24 h，预先将适量的CMACM用含20%胎牛血清的DMEM/F12（每100 mg CMACM用5 mL培养基）37℃浸泡24 h。1 000 r/min离心5 min，分别获取每个植入点所需的细胞和CMACM沉淀；将新鲜配制的0.5 mL纤维蛋白原和0.5 mL凝血酶分别加入准备好的细胞沉淀和CMACM沉淀中，分别混匀。

混合物分类：A组，异体软骨细胞复合CMACM和FG；B组，自体软骨细胞复合CMACM和FG；C组，CMACM和FG。每份A或B混合物约含5×107个细胞、50 mg CMACM和1 mL FG；每份C混合物约含50 mg CMACM和1 mL FG。

1.5 皮下植入及植入后观察

将每只兔子背部皮肤划分为6个区，分别植入A、B、C组混合物各两个点。标准化饲养，密切观察实验兔的一般情况和皮肤局部反应，观察并记录皮下植入体的形态、大小、软硬度等变化。

1.6 组织学检测

(2)对于北部湾经济区资本一体化的测度，下面将从北部湾经济区区内资本总流量来反映区内金融一体化的发展水平。区内资本总流量使用公式fil=(OFCt+IFCt)/GDPt来计算，通过对北部湾经济区历年数据的查阅(本文主要选取2008年—2011年全区GDP和进出口总额)，经过计算得到结果如下：

分别于植入后8周和12周取材，行组织病理学染色，HE染色显示基本的组织结构；Mallory染色显示组织中所含结缔组织的结构（胶原纤维被染成蓝色）；醛品红染色观察被染成紫色的弹性纤维；甲苯胺蓝和阿尔新兰染色显示软骨基质中的黏多糖成分（糖胺多糖），阳性结果为软骨基质呈紫色（甲苯胺蓝染色）和蓝色（阿尔新兰染色）。

2 结果

2.1 CMACM的性状与检测

CMACM呈白色粉末状，质地较均匀，使用前以完全培养基浸泡成悬液状。HE染色显示CMACM红染，微粒边缘粗糙，胶原纤维交错排列，未见软骨细胞（图1）。

2.2 软骨细胞体外扩增

原代细胞为小圆形，传代后生长迅速。第2代细胞呈圆形、多角形或梭形，有细胞群集现象，仍可见到同源细胞群（图2）。

2.3 植入物的体内观察

植入皮下的混合物即刻观察直径为2.3 cm，厚约3 mm，质软。A、B两组植入后24 h，触之可随皮肤移动，质软；1周左右变硬，具有弹性和韧性，在皮下移动性好；4周时体积明显缩小，直径约1 cm；8周时直径约0.5 cm；12周时呈扁平，几乎触摸不到。C组植入后质软，皮下物边界不清，2周左右稍硬，直径约1 cm，4周时几乎触摸不到。

图1 CMACM（HE，100×）

图2 第2代软骨细胞（100×）

图3 A组植入前（HE，100×）

图4 A组植入后8周（HE，100×）

图5 C组植入后8周（HE，100×）

图6 A组植入后12周（HE，100×）

图7 B组植入后12周（HE，40×）

图8 B组植入后12周（HE，100×）

图9 B组植入后12周（Mallory，40×）

植入前，HE染色示FG无色，基质粉染，细胞核呈蓝色，证实为混匀的软骨细胞、CMACM和FG（图3）。

8周时，A组HE染色显示软骨细胞较少，出现大量炎性细胞（图4），醛品红、甲苯胺蓝和阿尔新兰的软骨组织染色阴性；B组软骨细胞活力旺盛，细胞嗜碱性强，形成的类软骨样组织中有血管长入，其旁可见炎性细胞及未被完全吸收的CMACM，醛品红、甲苯胺蓝和阿尔新兰染色均阳性；C组HE染色示蛋白胶内无任何细胞，分布在蛋白胶内的CMACM周围有炎性细胞浸润（图5）。

12周时，A组中CMACM和细胞均处于被吸收状态（图6），醛品红、甲苯胺蓝和阿尔新兰染色阴性；B组软骨细胞活力旺盛，细胞嗜碱性强，形成的类软骨样组织中有血管长入，其旁未见炎性组织，植入的CMACM已被完全吸收。软骨组织厚度不超过1 mm，醛品红、甲苯胺蓝和阿尔新兰染色均呈阳性（图7～12）；C组已被完全吸收，未找到植入的组织。

图10 B组植入后12周（醛品红，40×）

图11 B组植入后12周（甲苯胺兰，40×）

图12 B组植入后12周（阿尔新兰，40×）

3 讨论

目前软骨细胞复合ACM的研究多聚焦于自体软骨细胞复合同种异体的ACM上，已经报道的结果均较满意。但是，尚未见到异体软骨细胞复合ACM或自体软骨细胞复合异种ACM的研究报道。

本实验结果显示，复合植入自体软骨细胞、异种CMACM和FG，皮下可以形成软骨样组织；而异体软骨细胞复合异种CMACM和FG的皮下植入，则未能形成软骨样组织。其可能的原因有：①移植细胞的异体排斥，对于其机制目前有多种解释[2]，而通过多种方法，可建立同种异体软骨细胞的免疫耐受[3－5]。②局部微环境因素影响，已有学者报道异体细胞复合某种支架可以修复关节软骨缺损[6－7]。③可能与材料的性质及软骨细胞供体的年龄有关。李景红等[8]将1月龄兔耳廓软骨细胞种于PDLLA上形成复合物，6 h后植于兔皮下，18周时可以形成基本接近正常软骨的新生软骨。吕威等[9]将出生3～5 d的新西兰大白兔四肢关节软骨组织酶解，分离出软骨细胞，体外扩增后接种到PLA三维可吸收支架上；再将软骨细胞-PLA复合物移植到成年新西兰大白兔的背部皮下，经过7周的体内培养，发现软骨细胞-PLA复合物在同种异体的动物体内形成新生软骨组织，且随着植入时间的延长，软骨基质的分泌增加，炎性细胞的浸润逐渐减轻。

此外，本实验结果显示，即使是自体耳软骨细胞所形成的植入物，植入后体积也明显缩小，且新生的软骨组织厚度不超过1 mm，其中还长入许多小血管，与文献报道相符，即当组织工程材料的厚度超过1 mm时，其内部的细胞将很难通过渗透作用获得营养，必须有毛细血管长入才能维持正常代谢[10]。

总之，猪源CMACM不能抵抗成年兔对异体软骨细胞的排斥反应，但是可以与自体软骨细胞和FG在皮下共同构建一定厚度的组织工程软骨。

[1]潘柏林,李健宁,王萍,等.微粒软骨脱细胞基质复合纤维蛋白凝胶构建软骨组织工程支架材料的研究[J].中国美容医学,2008, 17(5):679-682.

[2]Revell CM,Athanasiou KA.Success rates and immunologic responses of autogenic,allogenic,and xenogenic treatments to repair articular cartilage defects[J].Tissue Eng Part B Rev,2009,15(1):1-15.

[3]吴海涛,李采,钟翠平.环孢霉素A对组织工程软骨同种异体移植的影响[J].中国眼耳鼻喉科杂志,2004,4(1):6-7.

[4]王树军,张惠珍,王颖,等.FasL+组织工程化猪软骨细胞的同种异体移植[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(14):2605-2608.

[5]胡洪亮,曹谊林,陈婷婷,等.同种异体组织工程化软骨局部免疫豁免诱导的实验[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(14): 2757-2760.

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[9]吕威,张连山,蔡哲,等.同种异体组织工程化软骨组织形成的初步研究[J].临床耳鼻咽喉科杂志,2004,18(8):485-487.

[10]王敏,裴海云,裴雪涛.脂肪来源干细胞的多向分化性及其在组织工程中的应用[J].军事医学科学院院刊,2009,33(4):381-384.

Preliminary Study on Subcutaneous Tissue-engineered Cartilage with Cartilage Microparticle Acellular Matrix and Fibrin Glue as Scaffold

NIE Fangfei,PAN Bailin,LI Jianning.Department of Plastic Surgery,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China.Corresponding author:LI Jianning.

ObjectiveTo evaluate the possibility of formation of subcutaneously implanted tissue-engineered cartilage using allograft chondrocytes mixed with xenogenic cartilage microparticle acellular matrix(CMACM)and fibrin glue（FG）as scaffold.MethodsChondrocytes were isolated from ears of adult New Zealand white rabbits.CMACM from porcine auricle was established and combined with FG and exoteric amplified chondrocytes.The compound was transplanted into the back of rabbits subcutaneously.The experiment was divided into three groups according to compound components。Group A,allograft chondrocytes mixed with CMACM and FG;Group B,autograft chondrocytes mixed with CMACM and FG;Group C with CMACM and FG.Five adult rabbits were used，and six regions were divided on the back of every rabbit.Each rabbit was injected compound of group A,B and C in two regions.Specimens were evaluated macroscopically,then harvested and detected histologically at 8 and 12 weeks after operation.ResultsIn group A and C compounds could not form subcutaneous cartilage tissues.While cartilage tissues formed with group B mixtures at 8 weeks;At 12 weeks,new-formed cartilage tissues seemed even more stabilized without inflammatory around it.The size of new-formed cartilage was obviously shrinked with small vessels growing into it and the thickness of new-formed cartilages was only 1 mm.ConclusionThe autogenic chondrocytes combining CMACM and FG matrix is a potential material to the cartilage tissue engineering.The volume and thickness of new-formed cartilage tissue is limited and micro-vessles growing into cartilage may contribute to longer survival for new tissues.

Allograft chondrocyte;Cartilage microparticle;Acellular matrix;Tissue engineering

Q813.1+2

A

1673－0364（2010）01－0005－04

2010年1月4日；

2010年2月10日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.01.002

国家自然科学基金项目（30672186）。

100191北京市北京大学第三医院成形外科。

李健宁。