酿酒酵母纯化低聚半乳糖

潘彬也，高艳玲，欧阳夷，张少辉

（上海交通大学a.农业与生物学院；b.陆伯勋食品安全研究中心，上海 200240）

酿酒酵母纯化低聚半乳糖

潘彬也a，高艳玲a，欧阳夷a，张少辉b

（上海交通大学a.农业与生物学院；b.陆伯勋食品安全研究中心，上海 200240）

使用β-乳糖酶制得含低聚半乳糖的混合溶液，添加4种酿酒酵母对其使用微生物法纯化，采用脉冲安培检测器与高效阴离子交换色谱结合法对结果进行分析。结果表明，实验组中低聚半乳糖纯度均有明显提高，其中酿酒酵母GIM 2.91效果尤为显著，将低聚半乳糖纯度从对照组的30.76%提高至39.52%，升幅达28.48%。

低聚半乳糖；纯化；酿酒酵母

0 引 言

低聚半乳糖（Galacto-oligosaccharides，简称GOS）是一种功能性低聚糖，能改善肠道微生态平衡、防止便秘等[1-4]。酶法制备低聚半乳糖被广泛采用[5，6]。但产物中大量杂糖的存在掩盖了其功能特性，如葡萄糖会其会严重干扰其生理功能[7]。

目前低聚糖分离提纯的方法主要有色谱柱分离法[8]、膜分离法[9]、酶法[10]和微生物发酵法[11]。 其中微生物发酵法对设备要求低，分离周期短且能耗相对较低[12]。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae Hansen）可将葡萄糖葡萄糖、半乳糖等单糖吸入细胞内，酶解其为二氧化碳和酒精[13]。本工作拟用该微生物菌株作用于酶法制备的低聚半乳糖混合溶液，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测器检测反应前后低聚半乳糖的纯度变化，为今后研究单一组分低聚半乳糖的结构与功能特性打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

微生物菌种由广东省微生物菌种保藏中心提供：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Hansen（编号GIM 2.34）；椭圆酿酒酵母Saccharomyces cervisiae Hansen var.ellipsoideus（Hansen）Dekker（编号GIM 2.91）；酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Hansen（编号GIM 2.92）；酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Hansen（编号GIM 2.95）。

乳糖酶β-Galactosidase[14]（米曲霉）。

1.2 仪器与设备

DX-600型离子色谱仪（配有GP50梯度泵），戴安中国有限公司；ED50电化学检测器（金工作电极、Ag/AgCl参比电极），戴安中国有限公司；Chromeleon色谱工作站，戴安中国有限公司；CarboPacTMPA-1分析柱（4 mm×250 mm），戴安中国有限公司；CarboPacTMPA1保护柱（4 mm×50 mm），戴安中国有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶法制备含低聚半乳糖溶液

制备5瓶100 mL体积分数为32%的乳糖溶液，经121℃下高压灭菌15 min，溶液冷却后加入质量分数为1‰乳糖酶，在适宜温度下培养24 h后灭活。

1.3.2微生物法处理

将微生物菌种接种于适当的培养基中培养各两管，其中一管划平板，若菌种单一且长势良好，则保留另一管以待添加。向制得的5瓶低聚半乳糖底物溶液中添加等量四种酿酒酵母，在各菌的最适温度下反应24 h后灭活，留一瓶不作处理，作为空白对照。

1.3.3 样品的预处理

使用纤维素膜（0.22 μm）过滤样品溶液，除掉乳糖溶液可能对分析柱、检测器等产生污染和干扰的大分子物质，再用叠氮化钠溶液稀释10 000倍后送检。

1.3.3 低聚半乳糖的检测

采用离子色谱法，配合四电位脉冲安培检测器，利用混合溶液梯度淋洗，对GOS进行检测[15～18]。检测条件：流速1 mL/min,检测温度室温，进样体积20 L，采用梯度洗脱法，通34.475 kPa氮气检测，积分脉冲安培4电位波形检测法，其检测电压分别为：E1=+0.10 V，E2=-2.00 V，E3=+0.60 V，E4=-0.10 V。

1.4 色谱图计算

对比对照组的色谱图，确定实验组中各峰成分。按以下公式计算出该成分质量分数[19]。将对照组与实验组成分质量分数进行对比。

每组结果中，低聚糖峰的数量为低聚糖的种类数，所有低聚糖量的叠加为其低聚半乳糖总量，对比各组低聚半乳糖质量分数与转化率，进而分析实验结果。

2 结果与分析

预处理后的空白对照组样品色谱图如图1所示。同时对相同预处理条件下的4组实验样品进行检测，待绘制出色谱图及色谱参数后，以标准物色谱峰为根据进行定性与定量分析，以GIM 2.91为例，色谱图如图2所示。

图1中，对应色谱峰出峰时间：1为半乳糖9.00 min；2为葡萄糖10.20 min；3,4为3-α-半乳二糖类16.93 min和19.92 min；5为乳糖20.48 min；6为异构别乳二糖类23.50 min；7,8为三聚半乳二糖类24.82 min和26.20 min；9～12为四聚半乳二糖类28.65，29.63，33.07，34.70 min。

根据对照组色谱图确定样品色谱峰的成分，如图2确定峰1、峰2、峰5分别为半乳糖峰。葡萄糖峰和乳糖峰，介于葡萄糖峰与乳糖峰间的峰为3-α-半乳二糖类，乳糖峰后，24 min之前的成分为异构别乳二糖类，24 min到27 min间为三聚半乳二糖类，之后为四聚半乳二糖类。两图对比，可见峰的形状相似，但实验组酿酒教母GIM 2.91的低聚糖峰数目增加，面积也相对增大。确定峰的成分后，根据1.4中色谱图计算方法对各峰进行定量分析。

图2中，对应色谱峰出峰时间：1为半乳糖8.97 min；2为葡萄糖10.17 min；3,4为3-α-半乳二糖类16.85 min和19.90 min；5为乳糖20.50 min；6,7为异构别乳二糖类21.40 min和23.50 min；8,9为三聚半乳二糖类24.87 min和26.25 min；10～13为四聚半乳二糖类28.02，28.75，29.75，33.27 min。

经过对色谱仪原始数据表格的分析计算，得出低聚半乳糖溶液空白对照组与各实验组的各项参数如表1所示。并根据此结果对实验进行分析。

表1 各组样品低聚半乳糖量检测结果g

为更加直观地观察实验组与空白组的区别，拟将各组样品的单糖量（葡萄糖、半乳糖）进行对比，结果如图3所示；将各组样品中低聚半乳糖占总糖比例，即低聚糖纯度进行对比，结果如图4所示。

由图3可以看出，添加酿酒酵母能明显降低样品中的单糖量，葡萄糖量由空白组的9.51 g降至7.77 g至7.07 g不等，半乳糖量由5.07 g降至4.30 g至3.50 g不等。其中酿酒酵母GIM 2.91（椭圆酿酒酵母Saccha-romycescervisiaeHansenvar.ellipsoideusHansen Dekker）的发酵作用最佳，将葡萄糖量减少至7.07 g，幅度达25.66%；半乳糖量降至3.50 g，降幅30.97%；单糖总量14.58 g降至10.57 g，降幅27.50%。

图3中，每实验组第1列柱形代表单糖总量，第2列代表葡萄糖总量，第3列代表半乳糖总量。

正由于酿酒酵母对单糖的发酵作用，样品中的低聚半乳糖的相对量大大提高（图4）。其中发酵能力最强的酿酒酵母GIM 2.91，将低聚半乳糖在总糖中所占比例由空白组的30.76%提高至39.52%，提高近9个百分点，效果非常明显。

提高低聚糖纯度的同时，添加酿酒酵母也丰富了低聚半乳糖的种类。菌种GIM 2.92及GIM 2.95让低聚半乳糖的种类由原先的9种增加为11种（表1）。推测是微生物体内丰富的酶类催化了低聚糖的结构异化反应，有待研究。

3 结 论

低聚半乳糖作为一种功能性食品，是食品科学领域的研究热点。酶法制备低聚半乳糖的产物为葡萄糖、半乳糖、乳糖及GOS的混合物，但其中大量杂糖的存在掩盖了其功能特性。向酶法制备的低聚半乳糖底物溶液中添加4种酿酒酵母，采用离子色谱-脉冲安培检测器对产物进行检测，结果证明了酿酒酵母对单糖的发酵分解能力，其中菌种GIM 2.91的发酵能力尤为显著，将单糖总量降低了27.50%，从而大大提高了样品中的低聚半乳糖的相对质量分数，低聚半乳糖比例由空白组的30.76%提高至39.52%。同时，酿酒酵母的加入丰富了低聚半乳糖的种类，具体原因有待进一步研究。

实验证明酿酒酵母法可在一定程度上对酶法制备的低聚半乳糖溶液进行纯化，减少单糖对检测的干扰，为今后单一组分低聚半乳糖的结构与功能特性研究打下基础。

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Galacto-oligosaccharide purification by Saccharomyces cerevisiae Hansen

PAN Bin-yea,GAO Yan-linga,OUYANG Yia,ZHANG Shao-huib
（Shanghai Jiaotong University a.College of Agriculture and Biology;b.Bor S.Luh Food Safety Research Center,Shanghai 200240,China）

Add four kinds of saccharomyces cerevisiae hansen to galacto-oligosaccharide（GOS）mixture made by β-galactosidase and analyze the results with high performance anion exchange chromatography-pulsed amperometric detector（HPAEC-PAD）.The results show significant improvement of galacto-oligosaccharide purity,especially when treated by saccharomyces cerevisiae hansen GIM 2.91.Saccharomyces cerevisiae hansen GIM 2.91raises the purity of galacto-oligosaccharide by 28.48%,from 30.76%to 39.52%.

galacto-oligosaccharide；purification；saccharomyces cerevisiae Hansen

Q93-33

A

1001-2230（2011）08-0008-03

2011-05-09

国家“863”计划项目（2008AA10Z329）。

潘彬也（1988-），女，硕士研究生，研究方向为食品科学。

张少辉