益生菌豆乳发酵剂的筛选

包艳，苏芳，董喜梅，姚国强，王水泉，张和平

（1.内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特 010018；2.包头医学院 公共卫生学院，内蒙古包头 014030）

益生菌豆乳发酵剂的筛选

包艳1,2，苏芳1，董喜梅1，姚国强1，王水泉1，张和平1

（1.内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特 010018；2.包头医学院 公共卫生学院，内蒙古包头 014030）

为生产出具有良好风味和感官特性的发酵豆乳，选用Lactobacillus plantarum IMAU10156和L.IMAU60042分别与Lacbobacillus acidophilum S21-1，Streptococcus thermophilus S21-2，Bifidobacterium animalis L01-1复合发酵豆乳,接种量分别为1×107mL-1，于42℃发酵和4℃贮藏期间测定菌落总数、pH值、滴定酸度、黏度及脱水收缩性指标，并在贮藏1 d进行感官鉴评。结果表明，L.plantarum IMAU10156与S.thermophilus S21-2，L.plantarum IMAU60042与S.thermophilus S21-2复合具有良好的发酵特性，在6 h即可到达发酵终点，发酵豆乳产品具有纯正的豆乳发酵香味、酸甜适口、组织状态良好等特点，是两组具有开发价值的益生菌豆乳发酵剂。

发酵豆乳；益生菌；发酵特性

0 引 言

发酵豆乳（Fermented soymilk）是利用微生物的发酵作用制成的一种发酵豆制品。微生物发酵可分解大豆中的抗营养因子和消除豆腥味，使豆乳变成更易于消化吸收和营养美味的食品[1,2]，同时使大豆异黄酮转化为活性形式[3-5]，而且还会产生多种功能性多肽如降血压活性肽等[6]。尤其使用益生菌发酵剂发酵豆乳会使产品兼具一种或多种益生特性，增添了产品的营养保健功效。

本研究选用的L.plantarum IMAU10156和L.plan-tarum IMAU60042是我实验室从102株分离自自然发酵乳制品及酸粥中的植物乳杆菌中筛选出来的2株具有潜在益生特性的植物乳杆菌，具有较好的耐酸、耐胆盐、人工胃肠液、凝集和抑制常见胃肠道致病菌的特性。以2株植物乳杆菌分别与嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌相搭配复合发酵豆乳，对其发酵特性进行评价，为进一步研究开发出具有良好风味和感官的发酵豆乳提供了基础数据。

1 实 验

1.1 菌株与材料

本实验所使用的L.plantarum IMAU10156、L.plantarum IMAU60042、L.acidophilum S21-1、S.thermophilus S21-2、B.animalis L01-1均由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供。

MRS（Man Rogosa Sharpe broth）液体、固体培养基，BBL液体、固体培养基配方及材料也由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供。

大豆为市售黑龙江大豆。

1.2 仪器设备

NSC-II A-1200型无菌工作台，HITACHI U-2000型分光光度计，HIRAYAMA HA-300MIII型全自动高压灭菌器，ADVANTEC SP-650型全自动干热灭菌器，BACKMAN GS-15型离心机，雷磁pHSJ-3F型pH计，STAC-S45F恒温培养箱，FDM-Z 125-60型浆渣自动分离磨浆机，SRH 60-70型高压均质机，BROOKFIELD DV-E型黏度计等。

1.3 方法

1.3.1 菌种的活化及及菌粉的制备

将冷冻干燥保存的菌种L.plantarum IMAU10156、L.plantarum IMAU60042、S.thermophilus S21-2、L.acidophilum S21-1接种于MRS液体培养基中，置37℃培养18～22 h，传代培养2次。

将冷冻干燥保存的菌种B.animalis L01-1接种于BBL液体培养基中，置37℃厌氧培养18～22 h，传代培养2次。

分别取上述菌种培养液5 mL，经3,500×g离心10 min，收集菌体，加入5 mL灭菌生理盐水洗涤两次后，混匀制成供试菌悬液，待真空冷冻干燥后菌粉备用。

1.3.2 不同混合菌株在豆乳中发酵特性

将大豆称量后用自来水清洗3～4次，用水温90℃热水浸泡4 min，再用0.35%的NaHCO3溶液浸泡2 h，沥干泡豆的水，再清洗3～4次，将大豆与50～55℃的温水按1︰6的比例磨浆。豆渣中加入适量的温开水（50～55℃），充分搅拌后，再磨滤2次，3次所得的浆液混匀即成全浆，加水补足，制成豆水比为1∶7的豆浆。用120目的筛子过滤，除去豆渣，将豆浆连续煮沸3次。添加质量浓度为65 g/L蔗糖，过滤，15～25MPa下二次均质。经95℃（15 min）杀菌后，冷却至42℃左右接种，接种量分别为1×107mL-1，混匀，分装于已灭菌100 mL烧杯中，42℃恒温培养，每隔3 h取样测定其菌落总数、pH值、滴定酸度、黏度及脱水收缩性指标（平行实验重复3次，取平均值）。以pH值降到4.5为发酵终点，将样品转入4℃冰箱贮藏1 d，取样测定上述指标并进行感官鉴评[7，8]。

1.3.3 微生物指标的检测

将发酵样品用灭菌PBS梯度稀释至一定倍数后，采用平板倾注法，37℃培养 （包括含有双歧杆菌的需要厌氧）24～48 h计菌落总数，测定各菌株活菌数[9]。

1.3.4 理化指标检测

pH值采用精密pH计测量。

滴定酸度测定：取发酵豆乳9 g，加入10 mL的蒸馏水，混匀，加入2滴酚酞作指示剂，用标准浓度为0.1 mol/L的NaOH滴定。滴定酸度为100 mL发酵豆乳消耗浓度为0.1 mol/L的NaOH的毫升数。消耗1 mL浓度为0.1 mol/L的NaOH相当于1°T[8]。

黏度测定：将发酵乳样品调温至20～22℃，采用Brookfield DV-1 VISCOMETER黏度仪4#转子进行测定，其中转子转速为100 r/min，扭矩为10%～100%，测定时间为30 s。

脱水收缩性测定：称取15.0 g发酵豆乳样品，置于带有滤纸的漏斗中，室温放置90 min，收集滤液并称重[8,10]。脱水收缩性=（滤液质量/样品质量）×100%。

1.3.5 凝固型发酵豆乳的感官鉴评

由5名女性5名男性共10名学生组成感官鉴评小组，并接受感官鉴评培训。小组成员要求对发酵豆乳的表观、气味、风味和质地指标进行评价[8,11]。

表观指标——乳清析出、表面粗糙、黏聚性（保形能力）；

质地指标——剖面细腻度、硬度、稠度、拉丝性、平滑性；

气味指标——豆香味、酸味、臭味、蒸煮味、豆腥味；

风味指标——豆香味、豆腥味、酸甜比、苦味、异味、油腻性、涩味。

发酵豆乳的感官鉴评指标如上所述，感官鉴评得分采用100分制。

1.3.6 数据分析

实验数据采用SAS 9.0软件的ANOVA和CORR程序进行方差分析和相关性统计分析，采用Origin 7.0软件做图。

2 结果与讨论

2.1 凝乳时间

分 别 以L.plantarum IMAU10156，L.plantarum IMAU60042与L.acidophilum S21-1、S.thermophilus S21-2，B.animalis L01-1复合发酵豆乳，各组发酵豆乳凝乳和发酵时间测定结果如表1所示。

表1 各组复合发酵豆乳凝乳和发酵时间

由表1可以看出，发酵豆乳的凝乳时间越长则所需的发酵时间越长。各组复合发酵豆乳中凝乳和发酵时间最短的是L.plantarum IMAU10156和L.plantarum IMAU60042分别与S.thermophilus S21-2复配，凝乳时间仅为3 h，而发酵6 h即可到达发酵终点；凝乳和发酵时间最长的是L.plantarum IMAU60042与L.acidophilum S21-1复配，用时为7 h和15 h。可以发现，豆乳对于嗜热链球菌来讲是非常好的营养基质，能够使其快速的发酵产酸，双歧杆菌利用豆乳的效率为其次，而利用率最低的是嗜酸乳杆菌。在研究开发益生菌发酵剂时可以考虑添加嗜热链球菌或者双歧杆菌来加快发酵速度。

2.2 发酵和贮藏过程中活菌数的变化

分 别 以L.plantarum IMAU10156，L.plantarum IMAU60042与L.acidophilum S21-1，S.thermophilus S21-2，B.animalis L01-1复合发酵豆乳，不同发酵和贮藏时间活菌数测定结果如表2所示。

由表2可以看出，发酵结束后，各组复合发酵豆乳中益生菌L.plantarum IMAU10156与L.plantarum IMAU60042的活菌数在7.9～9.0 mL-1（对数值），在贮藏过程中，L.plantarum活菌数变化不显著（P＞0.05），基本趋于稳定。但对于产品4℃长期贮藏仍能否保持较高的活菌数，以符合欧盟规定益生菌产品在其货架期内益生菌活菌数至少保持在106cfu/g以上的要求[12]，我们仍需要实施延长贮藏时间的实验。研究中我们还发现，即使是同一菌属的不同菌株之间存在着某些性质的菌株特异性，继而导致虽分别与同一菌株搭配复合发酵豆乳时发酵特性的不同。

2.3 发酵和贮藏过程中的pH值变化

分 别 以L.plantarum IMAU10156，L.plantarum IMAU60042与L.acidophilum S21-1，S.thermophilus S21-2，B.animalis L01-1复合发酵豆乳，不同发酵和贮藏时间pH值测定结果如表3所示。

由表3可以看出，发酵过程中各菌株发酵豆乳的pH值显著下降（P＜0.05）。其中，S.thermophilus S21-2与两株植物乳杆菌复合发酵在6 h即可到达发酵终点，pH值下降速率约为0.40 h-1；L.plantarum IMAU60042与B.animalis L01-1复合发酵7 h到达终点，pH值下降速率约为0.35 h-1；而L.plantarum IMAU10156与L.acidophilum S21-1复配、IMAU10156与B.animalis L01-1和L.plantarum IMAU60042与L.acidophilum S21-1的复合发酵均较耗时约为10～15 h，导致pH值下降速率仅为0.16～0.24 h-1。显然，前3组发酵豆乳所用时间短，对于工业生产在节约动力和能源，以及保证产品质量方面都有非常大的优势。这主要是由于嗜热链球菌能够很快的利用豆乳中的糖迅速增殖，生成乳酸致使pH值快速下降的结果。贮藏1 d后，各复合发酵豆乳组pH值变化趋缓。这可能是由于，发酵过程使乳酸生成量增加，pH值下降，从而使豆乳由中性转变为酸性，而酸性环境又使菌体的增殖受到抑制，乳酸的生成速度下降，同时限制了pH值的进一步降低，如此使得pH值在贮藏期间保持了相对的稳定性。

2.4 发酵和贮藏过程中的滴定酸度变化

分 别 以L.plantarum IMAU10156，L.plantarum IMAU60042与L.acidophilum S21-1，S.thermophilus S21-2，B.animalis L01-1复合发酵豆乳，不同发酵和贮藏时间TA测定结果如表4所示。

滴定酸度反应了包括肽段和游离氨基酸残基在内的所有酸性基团的总和。由表4可知，发酵过程中各复合发酵豆乳的滴定酸度显著升高（P＜0.05），并且储藏1 d的过程中仍然会继续升高。其中L.plantarum IMAU60042与L.acidophilum S21-1复合发酵豆乳的滴定酸度显著高于其余5组（P＜0.05），而其余5组间变化值无显著性差异（P＞0.05）。

表2 各组复和发酵豆乳中活菌数随发酵和贮藏时间变化（对数值）mL-1

表3 各组复合发酵豆乳pH值随发酵和贮藏时间变化

2.5 发酵及贮藏过程中的黏度变化

分 别 以L.plantarum IMAU10156、L.plantarum IMAU60042与L.acidophilum S21-1、S.thermophilus S21-2、B.animalis L01-1复合发酵豆乳，不同发酵和贮藏时间黏度测定结果如表5所示。

由表5可以看出，发酵过程中各组发酵豆乳的黏度均显著升高 （P＜0.05）；L.plantarum IMAU10156和L.plantarum IMAU60042分别与S.thermophilus S21-2复配、L.plantarum IMAU60042与B.animalis L01-1复配发酵豆乳的黏度在发酵3 h时显著高于其余3个组（P＜0.05），但是在发酵结束和贮藏1 d时，各组黏度无显著性差异（P＞0.05）。这可能是由于，菌体增殖导致发酵豆乳中乳酸的含量增加，当达到足够浓度时，大豆蛋白凝固形成酸凝胶，使黏度迅速增加，菌体代谢受到抑制，乳酸的生成速度下降，限制了黏度继续上升，从而使发酵豆乳黏度保持相对稳定[13]。

许多研究表明，很多的S.thermophilus菌株可以产生胞外多糖，可以使酸奶样品具有良好的拉丝性或比较黏稠的质地[14，15]。本研究结果虽证实了菌株S.thermophilus S21-2对产品质地方面的积极影响，但是尚不能确定是否由于其产生胞外多糖所致。

2.6 发酵及贮藏过程中的脱水收缩敏感性变化

分 别 以L.plantarum IMAU10156，L.plantarum I MAU60042与L.acidophilum S21-1，S.thermophilus S21-2，B.animalis L01-1复合发酵豆乳，发酵结束及贮藏1 d的持水力测定结果如表6所示。

由表6可以看出，发酵结束和贮藏1 d的脱水收缩性最低的是2株植物乳杆菌分别与S.thermophilus S21-2复合发酵豆乳产品（P＜0.05），而脱水收缩性最高的是2株植物乳杆菌分别与B.animalis L01-1复合发酵豆乳。并且各组发酵豆乳的脱水收缩性贮藏1 d后比刚刚发酵结束时均有所降低。发酵产品的脱水收缩性越低，说明其产品的持水性越好，发酵豆乳凝胶体系中束缚水的含量就越多，在不破乳的情况下更能保持产品较好的风味和气味，使产品口感更佳，对于凝固型发酵豆乳是一个很大的优点。

2.7 发酵豆乳感官鉴评结果

益生菌的添加有助于提高发酵产品的感官品质[16]，本研究中应用2株具有潜在益生特性的植物乳杆菌分别与L.acidophilum S21-1、S.thermophilus S21-2、B.animalis L01-1复合制备发酵豆乳，制得产品的感官鉴评平均分值均在60～90分之间（图1），尤其是2株植物乳杆菌与S.thermophilus S21-2复合发酵豆乳产品，表观、质构、气味和风味显著高于其余4组（P＜0.05），发酵产品无乳清析出，表面细腻，黏聚性、剖面细腻度、硬度、稠度、拉丝性及平滑性显著优于其他发酵产品 （P＜0.05）；有明显豆香味，无臭味、蒸煮味和豆腥味；酸甜表5各组复合发酵豆乳黏度随发酵和贮藏时间变化/（Pa·s）比例适中，具有悦人的豆香味，无苦味、异味和涩味，不油腻。得分最低的为L.plantarum IMAU60042与B.animalis L01-1，主要原因是在产品的风味和气味上不及其余5组。

表4 各组复合发酵豆乳TA随发酵和贮藏时间变化/oT

?

表6 各组复合发酵豆乳在发酵结束及贮藏1 d的脱水收缩性

图1中，A组为L.plantarum IMAU10156+L.acidophilum S21-1；B组为L.plantarum IMAU10156+S.thermophilus S21-2；C组为L.plantarum IMAU10156+B.animalis L01-1；D组为L.plantarum IMAU60042+L.acidophilum S21-1；E组为L.plantarum IMAU60042+S.thermophilus S21-2；F组 为L.plantarum IMAU60042+B.animalis L01-1；角标含不同字母的数据之间差异显著（P＜0.05）。

3 结 论

（1）发酵试验中，2株具有潜在益生特性的植物乳杆菌分别与S.thermophilus S21-2复和发酵豆乳，凝乳时间为3 h，发酵时间为6 h；各组复合发酵豆乳中益生菌L.plantarum IMAU10156与L.plantarum IMAU60042的活菌数在7.9～9.0 mL-1（对数值）， 贮藏过程1 d，L.plantarum活菌数变化不显著（P＞0.05）；发酵期间pH值下降速率和滴定酸度上升速率显著高于其他组合（P＜0.05）。黏度与其他组结果无显著性差异（P＞0.05）。

（2）对各组产品进行感官鉴评，其中2株植物乳杆菌与S.thermophilus S21-2复合发酵豆乳产品，表观、质构、气味和风味显著高于其他组（P＜0.05），发酵产品无乳清析出，表面细腻，黏聚性、剖面细腻度、硬度、稠度、拉丝性及平滑性显著优于其他组（P＜0.05）；有明显豆香味，无臭味、蒸煮味和豆腥味；酸甜比例适中，具有悦人的豆香味，无苦味、异味和涩味，不油腻。

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Screening of probiotic strain of soymilk fermentation starter culture

BAO Yan1,2，SU Fang1，DONG Xi-mei1，YAO Guo-qiang1，WANG Shui-quan1，ZHANG He-ping1
（1.Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering Ministry of Education,Dairy Processing Laboratory of Na tional Dairy production technology and Research Center,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018 China；2.Public health college,Medical College of Baotou,Baotou 014030,China）

To produce fermented soy milk with favorable taste and sensory properties,L.plantarum IMAU10156 and L.plantarum IMAU60042 was repectively combined with L.acidophilum S21-1,S.thermophilus S21-2,B.animalis L01-1 for soy milk fermnetation.The initial inoculation were 1×107cfu/mL and then subjected to fermentation at 42℃followed with a 4℃storage for evaluation of viable counts,pH value,TA,viscosity,syneresis and sensory assessment（1d storage）.The results showed that fermented soy milk in the L.plantarum IMAU10156 and S.thermophilus S21-2,L.plantarum IMAU60042 and S.thermophilus S21-2 group was of better fermented characteristic and pleasing aroma of beans,moderate sweet and great appearance plus with 6h short fermentation time,indicating that it is a promising potential starter cuture for probiotic soy milk fermentation.

fermented soymilk；Probiotics；fermentation properties

TS252.54

A

1001-2230（2011）08-0011-05

2011-05-09

国家科技支撑计划（2009BADC1B01）；现代农业产业技术体系建设专项资金资助。

包艳（1977-）,女,博士研究生,从事益生菌方面的研究。

张和平