葡萄糖和胰岛素对4T1肿瘤细胞IL-6 mRNA表达的影响

孙凤娥 刘玉霞 许郑林 胡洁

近年来，糖尿病和乳腺癌的关系受到广泛关注。大量研究显示，糖尿病患者发生乳腺癌的危险显著增加，糖尿病与乳腺癌的发生发展密切相关［1］。白介素-6(IL-6)是一种多效性细胞因子，对恶性肿瘤的发生发展及预后具有重要意义。目前有关葡萄糖和胰岛素对4T1肿瘤细胞分泌IL-6的影响，尚未见相关研究报道。本实验体外检测不同浓度的葡萄糖和胰岛素对4T1肿瘤细胞IL-6 mRNA表达的影响，为分析糖尿病与乳腺癌发生发展的关系提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 实验用肿瘤细胞株为小鼠乳腺癌细胞株(4T1肿瘤细胞，河北医科大学免疫学教研室冻存);IL-6、βactin引物(上海生工生物工程公司合成);Prime Script PT reagent Kit反转录反应试剂盒(宝生物工程有限公司);PCR扩增试剂TaKaRa TaqTM(宝生物工程大连有限公司)。

1.2 4 T1 肿瘤细胞培养 4T1肿瘤细胞复苏后，以2×105/ml的浓度接种于RPMI 1640培养基(其中含10%的胎牛血清，100 U/m l的青霉素，100 μg/ml的链霉素)中，置于 37℃、5%CO2的培养箱培养，24～48 h换液1次，当细胞生长至90%以上时进行传代。

1.3 实验分组 取对数生长期的4T1肿瘤细胞进行分组实验。根据培养液加入葡萄糖和胰岛素浓度的不同，将实验所用细胞分为15组:A组(对照组)只加RPMI1640培养液(不含葡萄糖和胰岛素);B组RPMI 1640培养液+5 mmol/L葡萄糖;C组RPMI1640培养液+10 mmol/L葡萄糖;D组RPMI 1640培养液+25 mmol/L葡萄糖;E组RPMI1640培养液+35 mmol/L葡萄糖;F组RPMI 1640培养液+5μU/ml胰岛素;G组RPMI 1640培养液 +25μU/ml胰岛素;H组 RPMI 1640培养液125μU/ml胰岛素;I组 RPMI 1640培养液 +250μU/m l胰岛素;J组RPMI 1640培养液+1.25μU/m l胰岛素;K组 RPMI 1640培养液+5 mmol/L葡萄糖+5μU/m l胰岛素;L组RPMI 1640培养液+5 mmol/L葡萄糖+125μU/ml胰岛素;M组RPMI1640培养液+25mmol/L葡萄糖+125μU/ml胰岛素;N组RPMI1640培养液+25 mmol/L葡萄糖+5μU/ml胰岛素;O组RPMI 1640培养液+25 mmol/L葡萄糖 +1.25μU/m l胰岛素。

1.4 细胞总RNA提取 取对数生长期的4T1肿瘤细胞以终浓度1.5×105/ml接种于 6 孔细胞培养板上，A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O 组均设双复孔，每孔培养总量 3 m l，置37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱培养48 h。培养结束后收集细胞，提取细胞总RNA，用紫外分光光度计检测OD260/OD280的比值以验证RNA的纯度，比值＞1.8时方可用于RT-PCR检测。

1.5 cDNA合成及PCR反应 取总RNA 1μg，按逆转录试剂盒说明合成cDNA。β-actin和IL-6的引物经premier 5.0引物设计软件设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。实验中所用引物浓度均为10μmol/L。β-actin的扩增片段长度为 350 bp。上游:5’-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3’，下游:5’-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3’。IL-6 的扩增片段长度为582 bp:上游:5’-CACGGCCTTCCCTACTTCACA-3’，下游:5’-GGCATAACGCACTAGGTTTGCC-3’。

β-actin的扩增条件为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，扩增25个循环;72℃再延伸10 min。IL-6的扩增条件为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min，59℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，扩增 35 个循环;72℃再延伸10 min。取扩增产物5μl于2%琼脂糖凝胶上电泳，置于紫外透射仪下观察并拍照。

1.6 凝胶电泳图像分析 将凝胶电泳图像输入凝胶电泳图像分析系统进行表达强度分析。结果判定以IL-6与内参照β-actin的PCR产物条带灰度值之比(IL-6/β-actin)作为反映IL-6表达水平的相对指标。

1.7统计学分析应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以±s表示，多个样本均数间比较用单因素方差分析，多个样本均数间两两比较用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的葡萄糖对4T1肿瘤细胞IL-6 mRNA表达的影响 D、E组IL-6 mRNA的表达［分别为(0.90±0.17)和(0.91±0.16)］高于A组(0.47±0.06)，差异有统计学意义(P＜0.05);而B、C组IL-6 mRNA的表达［分别为(0.57±0.13)和0.60±0.18)］与A组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见图1。

图1 不同浓度葡萄糖组4T1肿瘤细胞IL-6 mRNA的表达Mar:DNA Marker

2.2 不同浓度的胰岛素对4T1肿瘤细胞IL-6 mRNA表达的影响 F、G、H、I、J组4T1肿瘤细胞 IL-6 mRNA的表达［分别为(0.54±0.14)、(0.57±0.05)、(0.58±0.05)、(0.61±0.12)和(0.58±0.12)］与A组(0.473±0.06)比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见图2。

2.3 不同浓度的葡萄糖和胰岛素同时作用对4T1肿瘤细胞IL-6 mRNA表达的影响 M、N、O组IL-6 mRNA的表达［分别为(0.91±0.12)、(0.90±0.16)和(0.91±0.10)］均高于 A 组(0.47±0.06)，差异有统计学意义(P＜0.05);而K、L组IL-6 mRNA的表达［(0.58±0.18)和(0.61±0.19)］与A组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见图3。

图2 不同浓度胰岛素组4T1肿瘤细胞IL-6 mRNA的表达Mar:DNA Marker

图3 不同浓度葡萄糖和胰岛素组4T1肿瘤细胞IL-6 mRNA的表达Mar:DNA Marker

3 讨论

在2型糖尿病的自然病程中，血浆葡萄糖和胰岛素浓度的变化贯穿于病程的始终。其中高葡萄糖血症是2型糖尿病的典型特征。有资料显示，糖尿病患者IL-6表达水平升高［2，3］，推测高血糖导致了胰岛细胞、单核细胞、血管内皮细胞等分泌IL-6增加;陈思娇等［4］发现，2型糖尿病患者血清IL-6水平高于健康对照组，而血糖控制良好者IL-6浓度与健康对照组无差异，相关分析显示IL-6水平和胰岛素浓度关系不大，但与血糖浓度呈显著正相关;高浓度葡萄糖能促进IL-6的生成在体外实验中也得到了证实。本实验结果显示:高浓度的葡萄糖能够上调4T1肿瘤细胞IL-6 mRNA的表达;胰岛素浓度的变化不影响4T1肿瘤细胞IL-6 mRNA的表达。与以往研究结果一致。提示在糖尿病整个病程中，IL-6分泌增多系由高葡萄糖血症所致，胰岛素浓度对IL-6分泌的影响较小。

IL-6由活化的单核巨噬细胞、T淋巴细胞、内皮细胞、胰岛细胞等分泌，具有多种生物学活性。大量研究表明，恶性肿瘤的发生发展、侵袭转移与体内产生的IL-6密切相关［5，6］。在对乳腺癌的研究中发现，IL-6在乳腺癌组织的表达明显高于其在正常乳腺组织中的表达［7］;乳腺癌患者与健康女性相比，血清中IL-6浓度较高［8］;乳腺癌患者中IL-6血清水平升高是其预后不佳的标志［9］。现已阐明，IL-6可通过多种途径产生肿瘤免疫抑制作用［10-12］:(1)能抑制抗原提呈细胞的抗原提呈功能;(2)能促使肿瘤细胞合成大量前列腺素E2(PGE2);(3)抑制T细胞和单核巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF);(4)促进抑制性细胞因子IL-10的产生，抑制IL-12的合成;(5)能拮抗TIL细胞的细胞毒性等。另外，IL-6能激活癌基因信号转导途径，致使细胞生存期延长，细胞增殖、分裂能力增强，与肿瘤发生发展密切相关。

结合本实验结果推测，高浓度的葡萄糖能够促进体内正常细胞和乳腺癌细胞IL-6分泌增加，进而发挥免疫抑制作用，与乳腺癌的发生发展有关。因此，对于糖尿病患者以及糖尿病伴有乳腺癌的患者，应该严格控制血糖，减少IL-6的分泌，以抑制乳腺癌的发生发展及转移，进而改善生活质量，延长寿命。

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