肿瘤组织进行法医DNA分析的研究进展

徐冬冬 黄花张明阳

(川北医学院法医学系四川南充637000;①四川省南充精神卫生中心;②南通大学法医系)

肿瘤组织进行法医DNA分析的研究进展

徐冬冬 黄花①张明阳②

(川北医学院法医学系四川南充637000;①四川省南充精神卫生中心;②南通大学法医系)

肿瘤法医学DNA分析遗传不稳定性短串联重复序列

肿瘤研究与法医DNA分型之间的关系可能并不明确，因为筛选法医分析用短患联重复序列(STR)一条重要的标准就是不能与已知疾病遗传标记之间有关联。然而，在一些特殊情况下肿瘤组织也可能用于法医DNA分型，例如对失踪人员或者灾难遇害者的个人识别，生前采集的活体组织可能是留下的唯一可用于DNA分析的样本。更为常见的情况是贴错标签或者弄混样本，通过DNA分型技术可将活检样本与患者之间匹配。类似的情况还有对被控父亲已经死亡的亲权鉴定，如果被控父亲已经下葬或者火化，可以调取现存组织样本进行检验。目前已知多种肿瘤存在遗传不稳定性，表现为癌细胞上的杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)或者微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)。这种不稳定性也出现于肿瘤组织的DNA重复序列，可能会影响到结构与之类似的法医DNA分型用STR遗传标记系统，从而影响DNA分型结果。

1 肿瘤遗传学

典型的肿瘤发生要依靠多个突变，这些突变存在个体差异且为单细胞的多个突变。肿瘤从发生到发展整个演变过程既与遗传突变和环境因素有关，也与基因变异和调控基因产物缺失有关。这个过程与癌基因的激活、抑癌基因的失活和调控细胞凋亡的基因改变有关。基因可以多种方式发生突变，包括缺失突变、点突变和染色体重排等方式均可导致癌基因的激活。抑癌基因可在表观遗传学改变等一些已知方式下失活，如启动子的甲基化。调控细胞生长和分化的原癌基因过度激活，突变后转化为癌基因。例如编码跨膜受体的c－erbB2(又叫Her2/ neu)原癌基因在多种人类肿瘤中出现过度表达，如乳腺癌、卵巢癌和胃癌等［1］。通过免疫组化实验发现，c－erbB2原癌基因在卵巢癌有＜25%过度表达，乳腺癌20%～30%，子宫内膜癌＜10%［2］。这种跨膜蛋白的过度表达与疾病的预示有潜在联系。其它癌基因，例如与信号转导蛋白有关的ras基因，由于点突变导致大量表达可见于多种肿瘤［3］。

抑癌基因是指细胞内具有限制原癌基因变异、抑制细胞恶性转化、维持细胞正常生长作用的基因。当抑癌基因不表达或失活时，癌变细胞便能逃避机体免疫机制的控制，导致细胞的恶化及转移。定位于染色体18q21的结直肠癌缺失基因(deleted in colorectal carcinoma，DCC)是一个重要的抑癌基因，与结直肠癌的发生、发展、转移、预后关系密切，在结直肠癌通常会表现出的LOH［4］。bcl－2基因的过度表达与细胞凋亡的负调控有关联，阻止了细胞凋亡［5］。由于肿瘤细胞的遗传不稳定性，基因组中的大量基因出现缺失或者功能性缺陷。在多种肿瘤中均发现了抑癌基因的缺失和(或)失活，而LOH或MSI都可导致这种情况发生。

2 杂合性缺失

杂合性缺失即一个位点上两个多态性的等位基因中的一个出现突变或缺失。LOH在肿瘤细胞中是一种非常常见的DNA变异，这种现象可经多种途径发生，包括基因缺失、基因转换、有丝分裂重组和染色体丢失。肿瘤发生时，缺失区域可表现为抑癌基因功能缺失，由于另一条染色体上的抑癌基因功能仍可能正常，因此人体仍可以健康活着。但根据Knudson的二次打击学说［6］，另一条染色体上的抑癌基因也会突变，从而失去对人体的保护。当LOH在基因组包含大量多态性位点的区域中遍布存在时，即意味着发生了染色体区域缺失。目前用于检测特定位点LOH的方法是对肿瘤细胞全基因组的扫描。最近兴起的人类基因组测序和生物信息学工具的使用，可以帮助快速准确的找到肿瘤相关基因。

3 微卫星不稳定性

微卫星是基因组中大量、随机存在的简单串联重复序列［7］。人类最常见的微卫星是CA二核苷酸重复，可在基因组中出现上万次。由于在小卫星中出现了等位基因重复次数的变异，因此大部分微卫星具有高度多态性。然而，每个个体特定的微卫星长度是固定的。MSI是指个体微卫星中出现了基因条带增多和大小的改变。MSI与DNA修复过程缺陷有关，通常是肿瘤发生的早期事件。与MSI有关的典型肿瘤是遗传性非息肉性结肠直肠癌。通过对结肠直肠癌的研究，人们发现了形成MSI的两种不同机制。第一种，错配修复基因产生遗传变异，导致了微卫星重复序列的复制错误未得到修复，产生了可能会使抑癌基因失活的移码突变;第二种，表观遗传学的改变如DNA甲基化可能会使重要的错配修复酶基因沉默。两种当中的任何机制，均可引起抑癌基因因缺失或者插入而失活，从而导致细胞过度增殖最终产生肿瘤。MSI还可见于其他一些恶性肿瘤，包括乳腺癌、膀胱癌和肺癌。Applied Biosystems公司应用法医分析用STR SGM Plus试剂盒对人体多种类型肿瘤进行研究，发现多个位点出现了LOH和MSI。

4 法医STR遗传标记

由于遗传不稳定性在肿瘤研究中的突出作用，一些研究人员开始在多种肿瘤组织中研究与法医分析用STR遗传标记的突变率。与此同时，基于四核苷酸重复序列的微卫星序列的法医分型用STR遗传标记也在国内外DNA分型中快速发展。基于此种原因，Hoff－Olsen等［8］将取自同一患者的血液样本和结肠直肠腺癌样本分别进行法医分析用四核苷酸遗传标记分型。通过比对发现，肿瘤组织的DNA分型均出现了MSI，其中hum-FES/FPS在群体调查研究改变频率最大，为17%。在肺癌、胰腺癌中也观察到类似的情况。这说明遗传不稳定性确实影响到了法医DNA分型用的四核苷酸重复微卫星。

由于表现出MSI和LOH的DNA分型结果很容易与自然操作误差混淆，因此在对肿瘤组织的DNA分型结果解释时应格外谨慎。由于新的等位基因的出现，MSI可表现出与原始供体不同长度的等位基因。如果MSI导致了重复基序相对于原始等位基因出现较短距离移动，这种情况很可能被DNA分析专家解释为影子带。影子带是法医DNA分型中最常见的现象，是由于PCR过程中出现了Taq聚合酶的滑动，从而导致检测到的产物与实际等位基因长度不同。影子带是使用Taq聚合酶扩增STR不可避免的现象［9］，当所扩增的在实际等位基因峰高＞4000 RFU(相对荧光的单位)的电泳图谱尤为明显。每个STR基因座甚至等位基因之间都有不同的影子带特征，但是很少见到影子带峰高超过相关等位基因峰高的15%。任何于影子带位置发现的峰高＞15%相关等位基因峰高的通常认为是混合DNA样本［9］。肿瘤组织DNA分型电泳图谱另一个特征是杂合子等位基因扩增不平衡。DNA扩增理想情况是杂合子的每个等位基因峰面积应该是相当的，等位基因之间的扩增效率差异导致了等位基因的不平衡扩增。而甲醛固定石蜡包埋肿瘤组织，由于DNA含量很小同时出现了降解，不平衡扩增现象尤为明显。微量DNA的扩增很容易出现DNA分型失败或部分分型，这种情况很可能被错误的解释为LOH。

当以口腔癌患者特别是在台湾嚼槟榔者的口腔拭子作为对照样本时，肿瘤患者医学样本用于法医DNA分型时出现的另一个问题［10，11］。刑事警察也曾多次将嚼过的槟榔残留物视为重要证据用于DNA分析。为了弄清口腔癌患者口腔拭子STRDNA分型的可能存在的问题，Pai CY等［12］将分别取自100名口腔癌患者，100名健康的嚼槟榔者和100名健康的不嚼槟榔者的口腔拭子和外周血样本分别进行AmpFlSTR Profiler(Applied Biosystems)9个STR位点试剂盒扩增。结果表明作为参照的外周血样本DNA分型与口腔拭子DNA分型在口腔癌患者中有33%的偏移。而两个健康对照组的外周血样本DNA分型与口腔拭子DNA分型均未表现出偏移，这表明是口腔癌而非嚼槟榔与检测到的遗传改变有关。在口腔癌患者中也检测到了LOH和微卫星不稳定，其中5名患者同时出现了这两种类型的遗传不稳定性。这些发现同样被很多其它的文献所证实［12］，因此当口腔癌患者出现遗传不稳定性时不应提取口腔试子用于法医学鉴定。

尽管法医分析用STR与肿瘤的发生、发展有关的基因之间并没有明确的关联，然而它们却受到了肿瘤发生引起的遗传学改变的影响。在多种类型肿瘤基因组中DNA重复区域均检测到了LOH和或MSI，这些区域也包括法医分析用STR的所有商业试剂盒。虽然已经明确指出了在肿瘤组织中法医分析用STR受到了LOH和MSI的影响，但是肿瘤组织用于法医鉴定的情况还是很少见的。对于肿瘤患者，一旦有多种DNA来源，不应选择活检组织。同样，对已经确诊为口腔癌的个体采集DNA参照样本时，也不应选用口腔拭子。如果不存在备选样本，研究者应该充分考虑到遗传不稳定性对被分析位点的潜在影响，同时谨慎发表自己的发现。

［1］Hynes NE.Amplification and overexpression of the erbB－2 gene in human tumors：its involvement in tumor development，significance as a prognostic factor，and potential as a target for cancer therapy［J］.Semin Cancer Biol，1993，4：19

［2］Villella JA，Cohen S，Smith DH，et al.HER－2/neu overexpression in uterine papillary serous cancers and its possible therapeutic implications［J］.Int J Gynecol Cancer，2006，16：1897

［3］胡勇，向近敏，赵文先.ras癌基因研究进展［J］.中国肿瘤临床，1991，18(3)：187

［4］赵坡，胡颖川.结直肠腺癌DCC基因微卫星丢失与预后［J］.中华病理学杂志，1996，25(4)：109

［5］陈扬超，周克元.Bcl－x基因及其对细胞凋亡的调节［J］.生物化学与生物物理进展，1999，26(6)：534

［6］Knudson A G.Hereditary cancer：two hits revisited［J］.Cancer Res Clin Oncol，1996，122(3)：135

［7］Hovig E，Smith－Sorensen B，Uitterlinden AG，et al.Detection of DNA variation in cancer［J］.Pharmacogenetics，1992，2：317

［8］Hoff－Olsen P，Meling GI，Olaisen B.Variation in mutation rate and direction between tetranucleotide STR loci in human colorectal carcinomas［J］.Ann Hum Genet，1998，62：1

［9］Gill P，Sparkes R，Kimpton C.Development of guidelines to designate alleles using an STR multiplex system［J］.Forensic Sci Int，1997，89：185

［10］Yang CH，Hsieh LL，Tsai CW，et al.Evaluation of the DNA stability of forensic markers used in betel－quid chewers＇oral swab samples and oral cancerous specimens：implications for forensic application［J］.J Forensic Sci，2003，48：88

［11］Pai CY，Hsieh LL，Tsai CW，et al.Allelic alterations at the STR markers in the buccal tissue cells of oral cancer patients and the oral epithelial cells of healthy betel quid－chewers：an evaluation of forensic applicability［J］.Forensic Sci Int，2002，129：158

［12］Zienolddiny S，Aguelon AM，Mironov N，et al.Genomic instability in oral squamous cell carcinoma：relationship to betel－quid chewing［J］.Oral Oncol，2004，40：298

(2010－10－11收稿)(肖永红 编辑)

DF 795.1

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1008－6633(2011)01－040－03