解毒通络法控制类风湿关节炎症状的实验研究*

刘 维 ，张 磊 ，吴沅皞

（1天津中医药大学第一附属医院，天津 300193；2.天津中医药大学，天津 300193）

解毒通络法控制类风湿关节炎症状的实验研究*

刘 维1，张 磊1，吴沅皞2

（1天津中医药大学第一附属医院，天津 300193；2.天津中医药大学，天津 300193）

[目的]探讨解毒通络法对类风湿关节炎病理进展中炎性因子的控制作用。[方法]复制胶原诱导型关节炎（CIA）大鼠，随机分为空白对照组，模型对照组，清痹片低剂量组、中剂量组、高剂量组，并以甲氨蝶呤治疗组作为阳性对照，致炎第21天起每天给药干预。从第1天初次免疫前开始，每隔2 d采用关节炎指数（AI）评分法分别评价各鼠前后4爪，记录多发性关节炎病变的发生及严重程度；同时用数显游标卡尺测量各鼠踝关节左右径（TD）、前后径（AD）及足垫厚度（PT）。分别于第1天和第49天对动物行X线放射学检查其后爪，并以X线片评分评价其关节破坏程度。[结果]模型组CIA大鼠关节炎指数改变量及X线片评分、双侧踝关节左右径、前后径及足垫厚度的改变量与空白对照组比较显著增加（P<0.01）；清痹片中、高剂量组关节炎指数改变量与模型组相比显著降低（P<0.01）；清痹片高剂量组X线片评分、踝关节左右径、前后径及足垫厚度的改变量与模型组相比显著降低（P<0.01）；清痹片高剂量组关节炎指数改变量、踝关节前后径改变量及X线片评分与阳性对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。[结论]解毒通络法能对抗胶原诱导型关节炎大鼠的炎症病变进展，减轻炎症症状。

解毒通络法；类风湿关节炎；胶原诱导型关节炎；关节炎症状

类风湿关节炎（RA）属于中医“痹证”范畴，因其疼痛遍历周身关节，后期身体羸弱、关节骨质破坏，又有骨痹、历节病、顽痹、尫痹等名称。RA是高致残性疾病，RA患者病程迁延，致残率高，3 a内关节破坏可达70%[1]，极大影响了患者群的生活质量，开展干预RA研究对于人类健康具有重要的意义。本研究以清痹片为研究载体，探讨解毒通络法组方的中药对RA关节炎症状进展的干预作用，为中医药治疗RA的机制研究和推广应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 牛Ⅱ型胶原（CollagenTypeⅡ，CⅡ）购自美国BD公司，不完全弗氏佐剂（CFA）购自美国Sigma公司，清痹片（QT），本院制剂室提供，由白花蛇舌草、青风藤、乳香、没药、黄芪、生地、甘草等组成。甲氨蝶呤（MTX），中国山西普德药业生产（批号：080706）。

1.2 动物造模 清洁级Lewis大鼠90只，雄性，7周龄，体质量（160±10）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：2005-0003。饲养环境：天津中医药大学第一附属医院清洁级动物房。实验前适应性饲养1周，自由饮水，摄食标准颗粒饲料，自然光线。动物房温度、湿度分别维持在20℃、70%左右。随机选取15只作为空白对照组，其他大鼠复制胶原诱导型关节炎（CIA）模型。造模前1 d将CⅡ溶于0.1mol/L冰醋酸中，浓度为2 g/L，在4℃下震荡使之充分溶解，置于4℃冰箱中过夜，冰浴下按1∶1比例与不完全弗氏佐剂混和充分乳化，麻醉大鼠后于尾根部皮内注射（每只0.2mL，含牛Ⅱ型胶原200μg），21 d后同法加强注射胶原乳化剂1次，空白对照组等量注射不完全弗氏佐剂[2]。

1.3 动物分组处理 选取造模成功的大鼠按随机数字表法随机分为模型对照组、QT低剂量组、QT中剂量组、QT高剂量组和阳性对照组，致炎第21天起每天给药：QT低、中、高剂量组以清痹片水溶液灌胃，剂量分别为0.36、1.0和1.8 g/（kg·d）；阳性对照组，腹腔注射MTX，7.5mg/（kg·周）；模型对照组和空白对照组给予10mL/（kg·d）生理盐水灌胃。实验期间均予SPF级普通饲料。

1.4 关节炎症状评分 从第1天初次免疫前开始，每隔2 d采用关节炎指数（AI）评分分级法评价各鼠前后4爪，记录多发性关节炎病变的发生及严重程度[3-4]。关节炎指数分为 5级（0～4分）：0分，关节无红肿。1分，1个关节部位发红，并（或）见肿胀。2分，发红并（或）肿胀关节>1个。3分，整个前（后）爪发红并（或）肿胀。4分，包括腕、踝关节全部严重红肿，或关节强直或畸形。总计最高可积16分（4分×4爪）。与初次免疫前相比，AI增加至少2分则认为具有关节炎症状。于AI评估同时，用数显游标卡尺测量各鼠踝关节左右径（TD）、前后径（AD）及足垫厚度（PT）[4-5]。

1.5 X线放射学检查 分别于第1天和第49天对动物行X线放射学检查其后爪，并以X线片评分评价其关节破坏程度：0分，正常关节。1分，1个位点的轻度骨质破坏，或骨质脱矿物质改变。2分，中度改变，一个小范围内2～4个点破坏，或1～2处骨侵蚀。3分，关节严重侵蚀。4分，关节完全破坏[4，6]。

1.6 统计学处理 整理各动物X线片评分数据及AI得分数据，计算各动物从21～34 d的AI改变量（ΔAI），分别计算各鼠双侧踝关节左右径、前后径及足垫厚度的改变量之和（ΔTD，ΔAD 及 ΔPT），以上实验数据应用SPSS13.0统计软件处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，正态分布资料组间比较采用单因素方差分析（oneway-ANOVA），偏态分布资料组间比较采用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CIA大鼠模型制备情况 初次免疫次日，大鼠免疫侧踝关节皮肤开始发红，肿胀。致炎后9～17 d，大鼠四肢关节红肿加重，以双侧后足踝关节明显，足垫增厚，大鼠活动量减少，食欲下降，毛发失去光泽，皮内注射部位出现多处小溃疡，随后结痂愈合。5周左右大鼠关节炎病变最为严重，活动困难，体质量增长缓慢，甚至下降。其后关节肿胀逐渐减退，部分大鼠出现关节强直，活动明显受限。所有造模大鼠均成功复制CIA模型，无死亡。

2.2 一般发病情况 空白对照组大鼠皮毛光泽色白，精神佳、活泼，饮食正常。模型组大鼠皮毛暗淡无光泽，部分大鼠爬行困难、紧张易怒、瘦弱蜷缩。清痹片低剂量组大鼠皮毛枯糙发黄，倦怠懒动，体质量增长缓慢。清痹片中、高剂量组和阳性对照组大鼠皮毛较光泽、精神活跃、进食状况较好。

2.3 解毒通络法对CIA大鼠关节炎指数及X线片评分的影响 如表1所示，模型组CIA大鼠关节炎指数改变量及X线片评分与空白对照组比较显著增加（P<0.01），清痹片中、高剂量组关节炎指数改变量与模型组相比显著降低（P<0.01），清痹片高剂量组X线片评分与模型组相比显著降低（P<0.01），清痹片高剂量组关节炎指数改变量及X线片评分与阳性对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 解毒通络法对CIA大鼠ΔAI及X线片评分的影响（±s)Tab.1 Effectof dispelling toxinsand dredging collaterals on AIand radiologicalscoresof the CIA rats（±s)分

表1 解毒通络法对CIA大鼠ΔAI及X线片评分的影响（±s)Tab.1 Effectof dispelling toxinsand dredging collaterals on AIand radiologicalscoresof the CIA rats（±s)分

注：与模型组比较*P<0.01；与阳性对照组比较#P<0.01。

组别 n空白对照组 15模型对照组 15 QT低剂量组 15 QT中剂量组 15 QT高剂量组 15阳性对照组 15 ΔAI X线片评分0.00±0.00* 0.00±0.00*6.13±1.28# 3.08±1.32#5.32±1.33# 2.84±1.16#3.54±1.41*# 2.31±1.28#1.11±0.93* 1.92±1.23*0.97±1.29* 1.84±1.14*

2.4 解毒通络法对CIA大鼠踝关节肿胀度的影响如表2所示，模型组CIA大鼠双侧踝关节左右径、前后径及足垫厚度的改变量与空白对照组比较均有显著增加（P<0.01）。清痹片中剂量组踝关节前后径及足垫厚度的改变量与模型组比较差异有显著性（P<0.01）。清痹片高剂量组踝关节左右径、前后径及足垫厚度的改变量与模型组比较均有显著降低（P<0.01），其中，前后径改变量与阳性对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

表2 解毒通络法对CIA大鼠ΔTD、ΔAD及ΔPT的影响（±s)Tab.2 Effectof dispelling toxinsand dredging collaterals on the TD,AD and PT of the CIA rats（±s)mm

表2 解毒通络法对CIA大鼠ΔTD、ΔAD及ΔPT的影响（±s)Tab.2 Effectof dispelling toxinsand dredging collaterals on the TD,AD and PT of the CIA rats（±s)mm

注：与模型组比较，*P<0.01；与阳性对照组比较，#P<0.01。

组别 n空白对照组 15模型对照组 15 QT低剂量组 15 QT中剂量组 15 QT高剂量组 15阳性对照组 15 ΔTD ΔAD ΔPT-0.31±0.12* 0.82±0.09* 0.46±0.29*-5.98±1.43# 5.23±1.32# 6.78±1.52-5.38±1.62# 4.56±1.24# 5.70±1.37#-4.50±1.64# 3.72±1.19*# 4.59±1.09*#-1.12±1.56*# 1.07±1.38* 2.01±1.17*#-0.57±0.89* 1.11±1.44* 2.41±1.58*

3 讨论

类风湿关节炎乃湿热瘀毒直达筋骨经隧，深伏痼结，且邪势猖獗，正气难达，甚难搜剔祛除，以致反复发作，损形坏体[7]。故本病治疗宜清热解毒、活血通络为基本治则。作为以解毒通络立法治疗类风湿关节炎湿热瘀阻型痹证协定处方的清痹片，是根据笔者多年临床经验方活血清痹方优化组合研制而成，由白花蛇舌草、青风藤、防风、乳香、没药、黄芪、生地、甘草等中药组成，临床对类风湿关节炎的近期以及远期疗效在临床已被证实[8-9]。

现代医学发现类风湿关节炎患者的外周血单核细胞及关节滑膜细胞大量分泌炎性细胞因子在RA的急性滑膜炎、滑膜纤维化、骨和软骨破坏等病情进展中起主导作用[10]。胶原诱导型关节炎动物模型可有效模拟类风湿关节炎的病理进展及症状特点，包括踝、腕等关节的红肿、强直、畸变等病变。本研究复制胶原诱导型关节炎大鼠并以清痹片干预，结果表明活血通络法能对抗胶原诱导型关节炎大鼠的炎症病变进展，减轻炎症症状，可能机制为抑制相关炎性因子的分泌、释放，并可能通过干预RA的Kupple样因子6-卵泡抑素相关蛋白（KLF6-FRP）调控体系抑制炎性因子和滑膜增生等病理进展，进一步的研究正在进行之中。

[1]中华医学会风湿病学分会.类风湿关节炎诊治指南（草案）[J].中华风湿病学杂志，2003，7(4)：250-252.

[2]Abdel-Motaal M Fouda,Mohamed Y Berika.Evaluation of the Effect of Hydroalcoholic Extract of Zingiber officinale Rhizomes in Rat Collagen-induced Arthritis[J]Basic&Clinical Pharmacology&Toxicology,2009,104(3):262-271.

[3]Young-SoolHah,Mi Jeong Sung,Hye Song Lim,etal.Dietary alpha lipoic acid supplementation prevents synovial in Xammation and bone destruction in collagen-induced arthriticmice[J].Rheumatol Int,Rheumatol Int,2010,23:[Epub ahead ofprint]

[4]JoanaRFAbreu,WendyDontje,Sarah Krausz,etal.ARac1 inhibitory peptide suppresses antibody production and paw swelling in the murine collagen-induced arthritismodel of rheumatoid arthritis[J].ArthritisResearch&Therapy,2010,12:2-4.

[5]Kop EN,Adriaansen J,SmeetsTJ,etal.CD97 neutralisation increases resistance tocollagen-induced arthritis in mice[J].Arthritis Res Ther,2006,8:155-157.

[6]Van Maanen MA,Lebre MC,van der Poll T,et al.Stimulation of nicotinic acetylcholine receptorsattenuates collagen-induced arthritis inmice[J].ArthritisRheum,2009,60(1):114-122.

[7]刘 维.毒痹论[J].中国中医基础医学杂志，2007，13（1）：15-17.

[8]刘 维，王 慧，左 芳，等.活血清痹片治疗类风湿关节炎60例疗效观察[J].中国中西医结合杂志，1998，18（12）：748－749.

[9]刘 维，王 慧，杨晓砚，等.清痹片治疗类风湿关节炎随访[J].天津中医药，2004，21（3）：196－198.

[10]Fionula Brennan,Jonathan Beech.Update on cytokines in rheumatoid arthritis[J].CurrOpin Rheumatol,2007,19:296-301.

Experimentalstudy on controlling symptomsof collagen-induced arthritiswith dispelling toxinsand dredging collaterals in rats

LIUWei1，ZHANG Lei1，WUYuan-hao2
（1.The FirstAffiliated Hospitalof Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China;2.Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China）

[Objective]To explore the controlling effects of dispelling toxins and dredging collaterals on the inflammatory factors of rheumatoid arthritis.[Methods]Themodelof collagen-induced arthritis(CIA)was duplicated in rats.Theywere random ly divided into blank group,modelcontrolgroup,Qingbi tabletsof low,middle,high dosage groups,positive controlgroup(methylaminopterin group).The administration ofdrugwasstarted from the21stday.Beginningatthe firstday after immunization thearthritisindex(AI)was recorded every other day to evaluate the severity of the arthritic development in 4 claws of the rats.Meanwhile,the transverse diameter(TD),anteroposterior diameter(AD)and thick of feetpad(PT)of the ratsweremeasured with a digital caliper.The hind pawswere used for radiographic evaluation at the firstand the 49th day.[Results]The scoresof the X-raysand change of the AI,TD,AD and PTwere increased significantlycomparedwith thenormalgroup(P<0.01).TheAIoftheratstreatedwithQingbitabletsofmiddleandhighdosageweredecreased significantly compared with themodelgroup(P<0.01).The scoresof the X-rays,TD,AD and PTof the rats treated with Qingbi tabletsof high dosagewere lowersignificantly compared with themodelgroup(P<0.01),and therewasno significantdifference of the scores of the X-rays,AIand AD of the rats treated with Qingbi tabletsofhigh dosage compared with positive controlgroup(P>0.05).[Conclusion]The dispelling toxins and dredging collateralsmethod can protectagainst inflammation pathological developmentof CIA rats and relieve inflammatory symptoms.

dispelling toxinsand dredging collateralsmethod;rheumatoid arthritis;collagen-induced arthritis;arthritic symptoms

R593.22

A

1672-1519(2011)03-0234-03

国家自然科学基金面上项目（30772809）。

刘 维（1962-），女，博士，教授，主任医师，博士生导师，主要从事风湿病研究工作。

2011-03-20）