西罗莫司血药浓度测定方法的建立及在肝移植患者中的应用

张 宁，吕慧怡*，邓 卅，范 青

西罗莫司(Sirolimus，SRL，商品名 Rapamune，雷帕霉素)，是一种大环内酯类免疫抑制剂，具有抗增殖、抗肿瘤及无肾毒性等特性，近年来逐渐应用于肝移植患者，使临床获得了防治肝移植术后肾功能不全、慢性排斥反应、肿瘤复发和提高移植物长期存活的新途径［1］。血药浓度监测对于保证SRL免疫抑制效果和临床安全性具有重要的意义。本文采用高效液相色谱法测定西罗莫司血药浓度，并分析此方法在肝移植患者中的合理应用。

1 实验材料

1.1 仪器 日本岛津HPLC色谱仪(LC-20AT二元梯度泵，COM-20A控制模块，SPD-M20A二极管阵列检测器)，QT-330型色谱柱恒温箱(大连三杰科技发展有限公司)，wi2568529电动离心机(东仪科技有限公司)，AS701KDT型超声波清洗器(北京鸿泰顺达科技有限公司)，XY-22型浓缩氮吹仪(青岛新益通有限公司)，YKH-Ⅱ 型液体快速混旋器(江西医疗器械厂)，AW-120型分析天平(日本岛津)。

1.2 药品与试剂 西罗莫司对照品(纯度为98.0%，天津新美科技有限公司)，32-去甲基雷帕霉素(纯度为98.0%，天津新美科技有限公司)，甲醇(色谱纯，天津康巢正兴科技发展有限公司)，氢氧化钠(分析纯，上海慈太龙实业有限公司)，乙腈(色谱纯，天津市康巢科技开发有限公司)，硫酸锌(分析纯，上海光铧科技有限公司)，1-氯正丁烷(≥99.5，广州伟伯化工有限公司)。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Hypersil ODS C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，大连伊利特分析仪器有限公司);流动相:乙腈-甲醇-水(7.5∶62.5∶30);流速:1.2 mL/min;紫外检测波长:276 nm;进样量:20 μL;柱温:50℃;内标物:32-去甲基雷帕霉素。在上述色谱条件下，全血中内源性杂质不影响西罗莫司与内标的分离测定，西罗莫司与内标的保留时间分别为16.3、26.8 min，空白全血、对照品及全血样品色谱图，如图1。

2.2 标准溶液配制

2.2.1 西罗莫司对照品溶液配制 精密称取西罗莫司标准品1 mg，置于10 mL的容量瓶中，以甲醇溶解并定容，制得浓度为100 μg/mL的西罗莫 司标准溶液，备用。

图1 西罗莫司的高效液相色谱图注:A.空白全血;B.对照品;C.全血样品;Ⅰ-SRL，Ⅱ-内标

2.2.2 内标溶液配制 精密称取32-去甲基雷帕霉素0.5 mg，置于10 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，制成浓度为50 μg/mL的内标液。精密量取内标液1 mL，置于100 mL的容量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀制得500 ng/mL的内标标准溶液，备用。

2.3 样品的处理 精密量取全血1.0 mL，置10 mL具塞离心试管中，加入500 ng/mL的内标溶液20 μL，旋涡混合 30 s后，加入蛋白沉淀剂(甲醇∶25%ZnSO4=70∶30)2.0 mL，旋涡混合30 s，4 500 r/min离心 10 min，取上清液加入0.1 mol/L NaOH 溶液 400 μL，混匀 15 s，加入1.0 mL 1-氯正丁烷，水平振荡10 min，4 500 r/min离心10 min。分离有机层，下层水相加入1.0 mL的1-氯正丁烷重复提取1次，合并有机层以N2流吹干。残渣加入甲醇50 μL旋涡混合30 s。取20 μL进样，记录色谱图，以SRL峰面积(Ai)与内标峰面积(As)之比Y代入标准曲线，计算SRL全血浓度。

2.4 标准曲线 分别精密吸取不同体积的西罗莫司标准溶液，置于10 mL具塞离心管中，加入精密量取的空白全血1.0 mL，混匀，使其浓度分别为2.0、4.0、8.0、15.0、30.0、50.0 ng/mL。按“2.3”操作，以不同浓度西罗莫司系列溶液的Ai/As来计算Y(Y=Ai/As)，以Y值为纵坐标、西罗莫司浓度C为横坐标进行线性回归。在2.0～50.0 ng/mL浓度范围内，血药浓度与峰面积比有良好线性关系，其回归方程为:Y=0.119 5 C+0.054 8(r=0.999 7)。

2.5 回收率及精密度 分别在1.0 mL空白全血中加入低、中、高3种浓度的西罗莫司溶液40 μL，混匀，使其浓度分别为 4.0、15.0、50.0 ng/mL，按“2.3”方法操作，将SRL峰面积与内标峰面积之比Y代入标准曲线，计算SRL全血浓度，以测得值与加入值之比计算相对回收率，分别为101.0%、94.3%和101.9%(n=5)。另以1.0 mL空白全血不加药品，按“2.3”操作，待萃取完毕后，在有机层中加入50%甲醇配制成的相应浓度的SRL溶液1.0 mL及内标标准溶液20 μL，继续按“2.3”操作，以此为标准，将测定相对回收率所得浓度值与此方法所测得浓度值相比，计算SRL绝对回收率分别为85.4%、81.9%和79.4%(n=5)。按照测定相对回收率方法计算SRL全血浓度，以1 d内5次测得的SRL浓度计算日内精密度，分别为3.3%、1.1%、3.1%，以1周内5次测定的SRL浓度计算日间精密度，分别为6.3%、1.4%、5.4%。日内、日间RSD均小于10%，表明该方法精密度良好。

3 临床应用

肝移植术后患者5例，男3例，女2例，平均年龄(40.2±11.5)岁。移植术后初期均采用以他克莫司为主的抗排斥治疗方案，其中2例患者术后1个月内肾功能减退，怀疑因药物副作用引起［2］，另外3例于术后6个月出现不能耐受的药物不良反应，如高血糖、肌肉酸痛等，换以西罗莫司为主的抗排斥治疗方案［3］。在服用西罗莫司片达到稳态后，在一次给药间隔口服西罗莫司2 mg后，于0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、16.0、24.0 h测定西罗莫司全血浓度(药-时曲线如图2)。应用DAS 2.0版，药物代谢动力学分析结果显示，西罗莫司 Cmax为(12.66±4.1)ng/mL，t1/2为(19.2±11.2)h，tmax为(1.8±0.3)h。在5例肝移植患者使用过程中，出现总胆固醇升高2例，服用瑞舒伐他汀片(10 mg，1次/d口服)1个月后总胆固醇均降至正常范围内，其他均未出现异常。

4 讨论

由于测定西罗莫司血药浓度时需用全血，而全血中的血细胞及蛋白质分子，会使萃取时发生乳化现象，对色谱柱分离产生较大的影响，因此，当西罗莫司从血细胞及血浆蛋白中提取至溶剂时，需加入蛋白沉淀试剂，沉淀、离心，从而消除细胞及蛋白干扰。而液-液萃取法是被测组分从生物基质中分离、纯化的常用方法，它可将被测组分自大量内源性物质中选择性地萃取分离。本实验以1-氯正丁烷为萃取液，有选择地将西罗莫司从混合液中萃取出来，然后将上层有机层(1-氯正丁烷)分离，再将萃取液挥发，最后得到浓集的被测组分。此方法简便，色谱分离效果较好，主峰易于识别，缺点在于提取物质杂质较多、回收率低，影响了其在HPLC中的应用。

图2 口服西罗莫司2 mg后药-时曲线

国内的研究表明，SRL治疗窗在稳态谷浓度4～8 ng/mL范围内［4-5］，而不是国外推荐应用的10～15 ng/mL。在这个范围内，既能有效预防移植肝发生急性排斥反应，又能减少其毒副作用。HPLC法测定西罗莫司的线性范围为2.0～50 ng/mL，覆盖SRL有效浓度范围，但临床监测中发现个别血药浓度＜2.0 ng/mL，超出本实验的线性范围，给临床调整给药剂量造成一些不便。

［1］ 李冠军，董桂青，金仲品.西罗莫司的研究进展［J］.中国医疗前沿，2008，3(2):34-36.

［2］ 马秋野，孙峰，武步强，等.肝移植术后他克莫司血药浓度与尿α1微球蛋白及微量白蛋白的相关性研究［J］.中国普外基础与临床杂志，2006，13(3):334-335.

［3］ Watson CJ，Gimson AE，Alexander GJ，et al.A randomized controlled trial of late conversion from calcineurin inhibitor(CNI)-based to sirolimus-based immunosuppression in liver transplant recipients with impaired renal function［J］.Liver Transpl，2007，13:1694-1702.

［4］ 张晓军，傅志仁.西罗莫司在肝移植中的临床应用［J］.肝胆胰外科杂志，2010，22(1):83-85.