米托蒽醌和多西紫杉醇联合用药对乳腺癌治疗的影响

(中国医科大学附属盛京医院，沈阳110004)

米托蒽醌是一种广谱的抗肿瘤类药物，其抗肿瘤活性高，而且抗瘤谱广泛。多西紫杉醇是近几年开发出的抗肿瘤新药，具有独特的抗癌作用机制，其抗瘤谱广。2010年3～8月，本研究采用米托蒽醌联合多西紫杉醇治疗乳腺癌细胞，通过免疫组化、Real-Time PCR和Western blot等技术，检测相关基因表达情况变化，探讨米托蒽醌和多西紫杉醇联合作用对乳腺癌治疗的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂 高糖DMEM培养基购自Thermo Fisher公司，MCF-7细胞购自上海细胞库。米托蒽醌(Mitoxantrone)杭州民生药厂，多西紫杉醇购自罗纳普朗克乐安制药有限公司，总RNA提取试剂盒、TIANScript cDNA第一链合成试剂盒2×Taq Real Master-Mix(SYBR Green)均购自天根生物科技(北京)有限公司，引物合成由上海生工公司完成，增殖细胞核抗原(PCNA)和Ki67单克隆抗体购于Abcam公司，免疫组化S-P试剂盒购自武汉博士德公司，其他为国产分析纯。

1.2 细胞培养 MCF-7细胞培养于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，在37℃、5%CO2饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，细胞贴壁生长。每2～3 d传代1次，实验均选用对数生长期细胞。

1.3 模型建立及分组 建立裸鼠皮下移植瘤模型，取对数生长期MCF-7细胞，细胞浓度为5×106个细胞/m l，分别接种于裸鼠右前肢腋下部皮下接种。裸鼠在SPF条件下饲养，室温21～25℃，相对湿度60% ～70%，皮肤消毒后将细胞悬液接种于裸鼠右腋皮下，每只注射0.2 ml细胞。36只造模成功裸鼠随机分为4组，A组为对照组:生理盐水1 ml/100 g腹腔注射;B组为米托蒽醌治疗组:注射米托蒽醌20 mg/kg;C组为多西紫杉醇治疗组:腹腔注射多西紫杉醇30 mg/kg;D组为米托蒽醌联合多西紫杉醇治疗组:腹腔注射米托蒽醌20 mg/kg和多西紫杉醇30 mg/kg。治疗3周后处死所有裸鼠，剖腹取瘤组织。

1.4 抑瘤率实验 完整剥离肿瘤，电子天平称重，称取瘤质量，计算肿瘤抑制率。瘤组织迅速经甲醛固定，常规石蜡包埋切片。

1.5 PCNA及Ki67蛋白检测 应用免疫组化S-P法，按照试剂盒使用说明书检测组织中PCNA及Ki67蛋白表达，400倍显微镜镜下每例随机取10个视野，计数PCNA与Ki67的标记指数，按阳性细胞百分率分为:阳性细胞率＜5%为阴性(－)，5%≤阳性细胞率＜40%为1级(+)，40%≤阳性细胞率＜70%为2级(++)，70%≤阳性细胞率为3级(+++)。

1.6 磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN)表达检测Western blot法检测组织标本中PTEN蛋白的表达，严格按说明书进行操作。

1.7 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料用±s表示，组间比较采用t检验，计数资料组间比较采有χ2检验。以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 肿瘤生长分析 见表1。

表1 各组治疗结束时肿瘤质量及其抑瘤率比较

2.2 PCNA及Ki67蛋白表达 PCNA阳性表达位于细胞核，A 组(0～3级:0、5.23%、31.27%、63.50%)无阴性，大多为3级阳性表达，B组(0～3级:0、18.16%、39.71%、42.13%)的阳性表达主要集中在 1、2级，与 C组(0～3级:0、31.14%、30.82%、38.04%)之间无差异，D 组(0 ～3 级:0、45.74%、27.83%、26.43%)的阳性表达主要集中在1级，P＜0.05。Ki67蛋白阳性表达，A 组(0～3级:0、10.75%、28.41%、60.84%)Ki67 蛋白的阳性表达主要集中在3级，而在B组(0～3级:0、13.56%、58.34%、28.10%)和 C 组(0 ～3 级:0、19.75%、45.57%、34.68%)中 Ki67蛋白的阳性表达主要为2 级，D 组(0 ～3 级:8.76%、35.28%、25.52%、30.44%)1 级阳性表达升高，P ＜0.05。

2.3 PTEN蛋白表达 PTEN蛋白的表达量在A、B、C和D组中依次升高，P＜0.05。见图1。

3 讨论

图1 各组PTEN蛋白表达

米托蒽醌是一种较新型的蒽环类药物，其抗肿瘤活性相当或略高于阿霉素，其作用机制可能是抑制RNA及DNA合成，直接插入DNA碱基对之间干扰转录过程，阻止mRNA的形成而起到抗肿瘤作用，米托蒽醌可与很多常用抗肿瘤药有协同作用［2］。多西紫杉醇是一种半合成的紫杉类化合物，是一种近年来常用来治疗乳腺癌有效的药物［3］。

本研究采用米托蒽醌、多西紫杉醇单独用药和米托蒽醌联合多西紫杉醇治疗乳腺癌成瘤裸鼠，通过免疫组化及Western blot等技术，检测肿瘤组织中PCNA［4］、Ki67［5］及 PTEN［6］蛋白的表达情况，探讨米托蒽醌和多西紫杉醇联合对乳腺癌治疗的作用机制。研究发现，应用米托蒽醌治疗后，肿瘤得到一定的治疗，多西紫杉醇的治疗情况与米托蒽醌的治疗情况相似，而米托蒽醌联合多西紫杉醇联合用药较单独米托蒽醌或多西紫杉醇治疗的效果更好，移植瘤的抑瘤率上升，肿瘤组织中PCNA蛋白和Ki67蛋白的阳性表达率下降，PTEN蛋白水平表达上升，其变化情况较为治疗组有显著差异。结果表明，米托蒽醌联合多西紫杉醇可能通过抑制致癌基因的表达，阻断肿瘤细胞中的蛋白质合成，抑制肿瘤细胞的增殖和癌症的发展，为新辅助化疗乳腺癌的联合用药进一步研究奠定一定的基础。

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