溶剂萃取/溶剂辅助风味蒸发-气相色谱/质谱联用分析野韭菜花挥发性成分

杨梦云，郑福平,2,*，段 艳，谢建春,2，黄明泉,2，任天鹭，孙宝国,2

(1.北京工商大学 北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048；2.食品添加剂与配料北京市高等学校工程研究中心，北京 100048)

溶剂萃取/溶剂辅助风味蒸发-气相色谱/质谱联用分析野韭菜花挥发性成分

杨梦云1，郑福平1,2,*，段 艳1，谢建春1,2，黄明泉1,2，任天鹭1，孙宝国1,2

(1.北京工商大学 北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048；2.食品添加剂与配料北京市高等学校工程研究中心，北京 100048)

以乙醚为溶剂，采用溶剂萃取/溶剂辅助风味蒸发法(solvent extraction/solvent-assisted flavor evaporation，SE/SAFE)提取新鲜野韭菜花精油，采用气相色谱-质谱联用(gas chromatography/mass spectrometry，GC-MS)法结合双柱(RTX-5色谱柱和DB-WAX色谱柱)保留指数(retention index，RI)定性分析精油中的挥发性成分。结果共鉴定出47种挥发性成分，其中包括含硫化合物28种、醛类4种、醇类3种、酮类3种、烃类化合物9种。含硫化合物数量多且含量大，是新鲜野韭菜花中的主要挥发性成分。

新鲜野韭菜花；溶剂萃取/溶剂辅助风味蒸发；气相色谱-质谱联用；挥发性成分

野韭菜为百合科葱属多年生宿根草本，主要分布于我国新疆东北部、青海北部、甘肃、宁夏北部、陕西北部、内蒙古、辽宁西部，长于海拔2000m以下的山坡、草地或沙丘上。野韭菜茎叶可炒食、做汤或馅食用，其花可直接食用或腌渍成野韭菜花酱食用。野韭菜不仅外形较之人工培植的韭菜更粗壮，生长环境绿色未受污染，其所含营养和药用价值也更加丰富。野韭菜嫩叶中的VC含量明显比同属的栽培植物青蒜、大蒜及韭菜高；野韭菜花中不仅粗蛋白、粗纤维、粗脂肪及多种维生素的含量高出普通韭菜花十几倍，其所含微量元素的总含量为30.59mg/100g，更是远比栽培韭菜花的7.02mg/100g高[1]。另外，野韭菜中的挥发性含硫化合物还具有良好的杀螨杀菌消炎、抗癌、降血脂以及预防心血管疾病等食疗功能[2-5]。随着人们生活水平的提高，这种绿色有机、营养丰富的可食保健野菜越来越受到人们的青睐。

硫醚及多硫醚等含硫化合物对于新鲜野韭菜花的特征香气有很大贡献，它们大多来自于S-烷基或S-烯基取代的半胱氨酸亚砜(S-alk(en)yl cysteine sulfoxide)在蒜氨酸酶(alliinase)作用下的分解产物，亚磺酸酯类成分即是分解时生成的一种中间体，性质很不稳定，受热容易分解成单硫醚和多硫醚类成分[6]。采用水蒸气蒸馏(hydro distillation，HD)、同时蒸馏萃取(simultaneous distillation extraction，SDE)等方法对样品预处理时，长时间加热则会使样品中亚磺酸酯类成分过度分解，产生过多的硫醚及多硫醚类成分，从而明显改变样品的原有香气。溶剂萃取/溶剂辅助风味蒸发法(solvent extraction/solvent-assisted flavor evaporation，SE/SAFE)是一种从复杂食品基质中温和、全面地提取挥发性成分的方法。该方法使挥发性成分在高真空接近室温条件下蒸发，样品中的热敏性挥发性成分损失少，萃取物具有样品原有的自然、逼真的香味，尤其适于野韭菜等复杂的天然食品中挥发性化合物的分离分析[7]。目前，国内外对大蒜、洋葱、韭菜、细叶韭等葱属植物中挥发性成分及其生理活性有许多研究[8-11]，但少见中国产新鲜野韭菜花挥发性成分的研究报道。因此，研究新鲜野韭菜花的挥发性成分及其生理活性，对于韭菜营养和药用成分的利用及其野韭菜绿色食品的开发都有着重要的意义。本实验采用SE/SAFE分离提取新鲜野韭菜花精油，采用气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)结合双柱技术对新鲜野韭菜花精油中的挥发性成分进行分析鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜野韭菜花，于8月初采于内蒙古赤峰巴林右旗大板镇。

乙醚(分析纯，重蒸处理)；无水硫酸钠(分析纯，120℃烘箱中烘烤5h，干燥器中冷却备用)；普通氮气(纯度 99.9%)；C7～C30正构烷烃标准品(色谱纯) 美国Supelco公司。

1.2 仪器与设备

溶剂辅助风味蒸发装置(定制加工) 北京肯堡博美玻璃仪器厂；FJ-110A型分子扩散泵机组 北京中科科仪技术发展有限公司；N-EVAP-12干浴氮吹仪 美国Organomation Associates公司；TRACE ULTRA-DSQⅡ气相色谱-质谱联用仪(配有Xcalibur 2.0.7数据处理系统和Nist 05质谱图数据库) 美国Thermo Fisher公司；6 9 8 0 N-5 9 7 3 I气相色谱-质谱联用仪(配有M S D ChemStationD.01.02.16数据处理系统和Nist 08质谱图数据库) 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 SE/SAFE法样品预处理

称取150g新鲜野韭菜花，用400mL乙醚于2℃条件下浸泡12h，倾析法得300mL绿色透明液体，依图1安装SAFE装置，将500mL圆底烧瓶作为蒸馏瓶置于30℃的恒温水浴中，将另一500mL圆底烧瓶作为接收瓶置于液氮环境中，冷阱中也充满液氮。SAFE的蒸馏头夹层循环水温度为40℃，用分子扩散泵使系统压力保持在10-4Pa。在2h内将300mL野韭菜花的乙醚浸提液由滴液漏斗缓慢、均匀地滴入蒸馏瓶中。

蒸发完后，将接收瓶取下，于背光处室温自然融化后，加入无水硫酸钠干燥12h，将萃取液过滤至圆底烧瓶中，40℃水浴条件下，用韦式精馏柱精馏滤液，得到约4mL芳香透明液体，用氮气流缓慢吹扫至总体积约0.5mL，封口置于冰箱中备用。

图1 SAFE装置示意图[7]Fig.1 Schematic diagram of an SAFE instrument

1.3.2 分析测定条件

1.3.2.1 TRACE ULTRA-DSQⅡ气相色谱-质谱联用分析

色谱分析条件：RTX-5(30m×0.25mm，0.25μm)色谱柱；柱升温程序：起始温度50℃，以5℃/min升温至130℃，再以10℃/min升温至150℃，再以3℃/min升温至180℃，保持1min，再以10℃/min升温至260℃，保持3min；进样口温度250℃；进样量1.0μL，分流比100:1；色谱柱载气均为氦气，其流速为1.0mL/min。

质谱检测条件：电子轰击离子源(electron impact，EI)，EI电子能量70eV；质谱传输线温度260℃；离子源温度250℃；扫描方式为全扫描，质量扫描范围15～450m/z，溶剂延迟时间2min。

1.3.2.2 6980N-5973I气相色谱-质谱联用分析

色谱分析条件：DB-Wax(30m×0.25mm，0.25μm)色谱柱；柱升温程序：起始温度50℃，以5℃/min升温至200℃，再以20℃/min升温至230℃，尾吹2min；进样口温度230℃；进样量2.0μL，分流比10:1；色谱柱载气均为氦气，其流速为1.0mL/min。

质谱检测条件： EI，EI电子能量70eV；质谱传输线温度280℃；离子源温度230℃；扫描方式为全扫描，质量扫描范围30～400m/z，溶剂延迟时间2min。

1.3.3 数据处理

GC-MS结果的分析鉴定采用在RTX-5、DB-Wax色谱柱上所得成分的气相色谱保留指数(retention index，RI)进行双柱定性，并分别结合Nist 05、Nist 08质谱图数据库进行检索，通过面积归一化法确定相对含量，对野韭菜花中各挥发性成分进行分析。

2 结果与分析

用SE/SAFE法得到的精油具有新鲜野韭菜花样浓郁的香气，自然逼真，总离子流图如图2所示，所鉴定出的挥发性成分结果如表1所示。

图2 新鲜野韭菜花挥发性成分总离子流图Fig.2 Total ion chromatograms of volatiles in fresh flowers of wild Chinese chive

由表1可知，以乙醚为溶剂，采用SE/SAFE法从新鲜野韭菜花中提取的挥发性化合物经过两种不同极性色谱柱共鉴定出47种成分，其中RTX-5色谱柱共鉴定出31种成分，DB-WAX色谱柱共鉴定出43种成分，其中27种成分在两只柱子上共同鉴定出。分析结果共包括含硫化合物28种(92.92%/77.48%)、醛类4种(—/0.24%)、醇类 3 种(— /0.36%)、酮类 3 种(1.69%/2.50%)、烃类9种(0.41%/2.90%)。其中含量较大的成分为甲基硫代亚磺酸甲酯(62.52%/25.97%)、甲基硫代磺酸甲酯(3.35%/9.04%)、二甲基三硫醚(6.17%/6.38%)、二甲基二硫醚(3.83%/4.43%)、3-乙烯基-1,2-二硫杂5-环己烯(2.37%/4.39%)、3-乙烯基-1,2-二硫杂4-环己烯(0.89%/8.77%)、(顺)-甲基丙烯基二硫醚(2.61%/3.79%)、(反)-甲基丙烯基二硫醚(1.76%/0.96%)、甲基叔丁基硫醚(2.03%/3.29%)、甲基烯丙基二硫醚(0.91%/3.34%)、5,8-二硫杂螺[3.4]辛烷(3.36%/1.80%)、3-羟基 -2-丁酮(1.55/1.02%)等。综上所述，含硫化合物是新鲜野韭菜花精油的主要组成部分。本实验中采用两根柱子鉴定的成分有些不同，总的来说在DB-WAX色谱柱上的色谱峰数目比在RTX-5色谱柱上的更多、峰信号更强，因此利用双柱色谱与保留指数相互补充、相互验证可以提高定性结果的可靠性。

在鉴定出的47种挥发性成分中，含硫化合物无论是从数量还是含量上都占绝对优势。一般而言，含硫香料化合物是各类香料化合物中阈值最低的一类，在浓度很低时可以对食品的特征香味产生很大的影响[12]。本实验中共鉴定出的28种含硫化合物中，包括2个硫代(亚)磺酸酯类(65.87%/35.01%)、14个硫醚和多硫醚类(18.92%/23.48%)和其他含硫化合物(16.26%/18.99%)。其中硫醚和多硫醚类是由S-烷基或S-烯基取代的半胱氨酸亚砜在蒜氨酸酶作用下分解而形成的[6]。新鲜野韭菜花精油中含量较大的甲基硫代亚磺酸甲酯(62.52%/25.97%)、甲基硫代磺酸甲酯(3.35%/9.04%)是S-甲基半胱氨酸亚砜降解时形成的一种不稳定中间体，它很容易进一步降解形成一系列S-甲基取代的单硫醚和多硫醚类成分，例如二甲基二硫醚和二甲基三硫醚等均来源于此[13-14]，其降解过程如图3所示。

图3 S-甲基取代的半胱氨酸硫氧化物降解形成二甲基二硫醚、二甲基三硫醚反应机理Fig. 3 Scheme of the formation of dimethyl disulfide and dimethyl trisulfide from S-methyl cysteine sulfoxide

在很多关于韭菜挥发油的研究报道中只鉴定出大量的硫醚和多硫醚类成分，而亚磺酸酯类成分很少量甚至没有，这是由于样品预处理方法中提取温度过高且加热

时间过长造成了不稳定亚磺酸酯类成分的降解。因此，合适的样品预处理方法对于各种挥发性含硫化合物的提取比例有很大影响。如图4所示，比较了吴莉等[15]、王鸿梅等[16]、Pino等[17]分别采用SE、HD、SDE方法与本实验所采用的SE/SAFE预处理方法对甲基硫代亚磺酸甲酯、甲基硫代磺酸甲酯、二甲基二硫醚及二甲基三硫醚的不同提取效果。

表1 新鲜野韭菜花精油挥发性成分的GC-MS分析结果Table 1 GC-MS analysis of volatiles in fresh flowers of wild Chinese chive

图4 3种提取方法与SE/SAFE提取方法对4种含硫化合物提取效果的比较Fig.4 Comparison of 3 different extraction methods on extraction efficiencies of 4 sulfur-containing compounds

从图4可知， HD和 SDE长时间高温蒸馏所得的韭菜精油中，甲基硫代亚磺酸甲酯全部分解，而溶剂萃取法提取出的三种含硫化合物的量都很大，但同时也会萃取出很多不挥发性物质，不利于GC-MS检测。而本实验中采用SE/SAFE提取的野韭菜花精油中含有大量的甲基硫代亚磺酸甲酯、甲基硫代磺酸甲酯、二甲基二硫醚及二甲基三硫醚的量较少，这表明SE/SAFE方法可以很好的避免因热敏性物质的过度分解而使萃取物香气发生明显改变，最大限度地保持样品原有的特征香气。大多含硫化合物均具有强烈的葱蒜、洋葱样等辛香香气，不仅是野韭菜花中的主要香气成分，还是重要的生理活性物质，例如，二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、甲基烯丙基三硫醚、蒜辣素等在体外大部分均能抑制ADP诱导的血小板聚集[18]；S-甲基甲烷硫代亚磺酸酯对于食品中的微生物——Escherichia coliO157:H7有很好的杀菌性[19]；除此之外，挥发性含硫化合物还可以抗菌消炎，对于治疗癌症、高血压以及冠心病等均有一定的作用。

醛类化合物的阈值一般较低，所以它们在浓度较低时对野韭菜花整体香气会产生比醇类和酮类更大的影响。本实验结果共鉴定出4种醛(0.24%)，其中2-甲基-2-丁烯醛(0.03%)天然存在于香叶油、洋葱、大蒜、薄荷、炖鸡肉中，具有清香、坚果香，并带有水果味；(反)-2-己烯醛(0.05%)天然存在于苹果、葡萄、覆盆子、草莓等水果中，具有清香、果香、辛香、脂肪香，类似新鲜洋葱的味道，是鲜韭菜中的重要香味成分[19]；这些醛类成分共同赋予了新鲜野韭菜花一定的清香和花果香。

醇类化合物和酮类化合物大部分都具有令人愉快的香气，新鲜野韭菜花中所含大多为不饱和醇，它们的风味阈值较低，对风味贡献较大。其中含量较大的为3-羟基-2-丁酮(1.55/1.02%)，它高度稀释后有令人愉快的甜香、奶香、脂肪香样香气；苯甲醇天然存在于苹果、圆柚汁、桃子、丁香花等中，具有甜的果香、花香香气；4-甲氧基苯甲醇又称茴香醇，天然存在于香子兰荚、茴香子油、蜜中，具有花香、桃子、甘草、樱桃的味道；2(3H)-5-戊基-呋喃酮天然存在于桃子、杏子、番茄中，具有奶油、椰子样香气[20]；这些化合物对野韭菜花的整体香味起到柔和修饰作用。烃类化合物具有微弱的石油气息，在野韭菜花中虽然含量较大，但大部分属于高碳烃类，这些化合物可能来自花蕾中未成熟种子及其外壳的蜡质层，对新鲜野韭菜花的整体香气贡献不大。

3 结 论

3.1 SE/SAFE法在高真空条件下低温提取的优点是，能够有效完整地提取出新鲜野韭菜花中的挥发性成分，野韭菜花精油中很少有热敏性成分甲基硫代亚磺酸甲酯、甲基硫代磺酸甲酯的分解，保持了新鲜野韭菜花的原有香气成分。本实验采用GC-M S结合双柱(RTX-5色谱柱、DB-WAX色谱柱)分离同一样品，根据其峰面积和保留指数等定性，可以提高样品成分识别的准确性。

3.2 采用SE/SAFE法和GC-MS从新鲜野韭菜花中共分离鉴定出47种挥发性化合物，占色谱流出成分总量的95.02%/83.48%，其中对新鲜野韭菜花整体风味的形成起主要作用的挥发性成分有甲基硫代亚磺酸甲酯(62.52%/25.97%)、甲基硫代磺酸甲酯(3.35%/9.04%)、二甲基三硫醚(6.17%/6.38%)、二甲基二硫醚(3.83%/4.43%)、3-乙烯基-1,2-二硫杂5-环己烯(2.37%/4.39%)、3-乙烯基-1,2-二硫杂4-环己烯(0.89%/8.77%)、(顺)-甲基丙烯基二硫醚(2.61%/3.79%)、(反)-甲基丙烯基二硫醚(1.76%/0.96%)、甲基叔丁基硫醚(2.03%/3.29%)、甲基烯丙基二硫醚(0.91%/3.34%)、5,8-二硫杂螺[3.4]辛烷(3.36%/1.80%)、3-羟基 -2-丁酮(1.55%/1.02%)、(反)-2-己烯醛(— /0.05%)等，挥发性成分中以含硫化合物为主，少量醛、醇、酮类化合物相互作用构成了新鲜野韭菜花的整体香气。

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Analysis of Volatiles in Wild Chinese Chive Flowers by Solvent Extraction/Solvent-Assisted Flavor Evaporation Coupled with Gas Chromatography-Mass Spectrometry

YANG Meng-yun1，ZHENG Fu-ping1,2,*，DUAN Yan1，XIE Jian-chun1,2，HUANG Ming-quan1,2，REN Tian-lu1，SUN Bao-guo1,2
(1. Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing 100048, China)

The essential oil in fresh flowers of wild Chinese chive was extracted by solvent extraction/solvent-assisted flavor evaporation (SE/SAFE) and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) carried out on the non-polar capillary column RTX-5 and the polar capillary column DB-WAX, respectively based on retention index (RI). Totally 47 compounds were identified, including 28 sulfur-containing compounds, 4 aldehydes, 3 alcohols, 3 ketones and 9 hydrocarbons.The major volatiles of fresh flowers of wild Chinese chive were sulfur-containing compounds.

fresh wild Chinese chive flowers；solvent extraction/solvent-assisted flavor evaporation (SE/SAFE)；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)；volatiles

TS207.3

A

1002-6630(2011)20-0211-06

2011-06-30

国家“863”计划项目(2011AA100903)；北京市属高等学校人才强教计划项目(PHR20090504)

杨梦云(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为香料化学。E-mail：yangmengyun137@126.com

*通信作者：郑福平(1969—)，男，教授，博士，研究方向为香料化学。E-mail：zhengfp@th.btbu.edu.cn