采用原子力显微镜研究刺参体壁酶促溶性胶原蛋白的溶液聚集状态*

董秀萍，朱蓓薇，祁立波，郑杰，张爽，姜丹

1(大连工业大学，食品学院，辽宁大连，116034) 2(江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇 江，212013)3(大连魁氏食品有限公司，辽宁大连，116101)

采用原子力显微镜研究刺参体壁酶促溶性胶原蛋白的溶液聚集状态*

董秀萍1，2，朱蓓薇1，2，祁立波3，郑杰2，张爽1，姜丹1

1(大连工业大学，食品学院，辽宁大连，116034) 2(江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇 江，212013)3(大连魁氏食品有限公司，辽宁大连，116101)

为 研究刺参热加工过程中体壁胶原蛋白的物性变化规律，利用原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM)考察样品浓度、溶剂和热处理条件对刺参体壁酶促溶性胶原蛋白(pepsin-soluble collagen，PSC)溶液聚集状态的影响。结果表明:在乙酸缓冲液(pH 2.7)、PBS缓冲液(pH 7.2)和超纯水中，海参体壁酶促溶性胶原蛋白均随着浓度的增大而逐渐开始自组装，并最终形成无规则的团状结构或者片状网络结构。但是，溶剂不同，其开始自组装所需要的胶原蛋白浓度也不同。随着加热温度的升高或加热时间的延长，刺参体壁酶促溶性胶原蛋白分子逐渐聚集成网络结构，但加热温度超过100℃或时间超过2 h后，其交联程度逐渐降低，网络结构逐渐消失。

刺 参体壁，PSC，AFM，聚集状态

刺参(Stichopus japonicus)属棘皮动物门，是一种珍贵的海洋无脊椎动物［1］。体壁是刺参主要的食用部位，主要由上皮组织和真皮结缔组织构成［2－3］。刺参体壁蛋白的高甘氨酸含量，以及羟脯氨酸和羟赖氨酸的存在，表明其以胶原蛋白为主体［4－5］。在热加工过程中，刺参的组织结构和流变学性质等会随着热处理条件的变化而发生明显变化，这主要是由于胶原蛋白发生热变性或凝胶化所导致的［6］，或者说，是由其真皮结缔组织细胞间所填充的胶原类物质发生改变所引起的［7－8］。因此，研究刺参体壁胶原蛋白对指导刺参的加工具有重要意义。

自1986年Binning［9］发明原子力显微镜以来，该设备已经广泛用于生物领域的各个方面，具有清晰度高、分辨率高和制样要求相对简单等特点［10］。本文从刺参体壁中提取酶促溶性胶原蛋白，并采用原子力显微镜对其在不同条件下的溶液聚集状态进行研究，可以从一定程度上反映加工过程中刺参胶原蛋白的变化规律，从而为进一步实现对刺参热加工过程物性变化的有效控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活刺参，产地为大连海洋岛;刺参体壁酶促溶性胶原蛋白，自制;胃蛋白酶，购于Sigma公司;其余试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器和设备

2KBTES-55型真空冷冻干燥机(美国，Virtis);Z323K型冷冻离心机(德国，HERMLE);UV-2100分光光度计(美国，UNICO);YC-1层析实验冷柜(北京博医康实验仪器有限公司);EMS-4B磁力搅拌器(天津欧诺仪器有限公司);DimensionTM3100原子力显微镜(美国，TMC)。

1.3 试验方法

1.3.1 刺参体壁PSC的制备

参照李翠翠等所述的方法［11］，采用胃蛋白酶从刺参体壁中提取得到较高纯度的胶原蛋白。所得胶原蛋白的纯度通过紫外吸收光谱和红外吸收光谱进行鉴定。

1.3.2 不同条件下刺参体壁PSC溶液的聚集状态

1.3.2.1 样品浓度和溶剂对刺参体壁PSC溶液聚集状态的影响

分别用0.2 mol/L乙酸缓冲液(pH值2.7)、超纯水和0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH值7.2)溶解刺参体壁PSC，配制质量浓度为4.0 mg/mL的储备液。然后将储备液用不同的溶剂进行稀释，分别得到以下浓度的稀释液:0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL 和2.0 mg/mL。采用AFM进行观察，考察样品浓度和溶剂对胶原蛋白溶液聚集状态的影响。

1.3.2.2 加热温度对刺参体壁PSC溶液聚集状态的影响

将刺参体壁PSC溶解于pH值2.7的乙酸缓冲液中，在浓度为0.01 mg/mL、加热时间为0.5 h的条件下，考察不同加热温度对样品胶原蛋白溶液聚集状态的影响。以未经加热的刺参体壁PSC溶液作为对照。

1.3.2.3 加热时间对刺参体壁PSC溶液聚集状态的影响

将刺参体壁PSC溶解于pH值2.7的乙酸缓冲液中，在浓度为0.01 mg/mL、加热温度为80℃的条件下，考察不同加热时间对胶原蛋白溶液聚集状态的影响。以未经加热的刺参体壁PSC溶液作为对照。

1.3.3 AFM样品制备及观察

1.3.3.1 AFM样品制备

准确移取5 μL样品溶液，滴于新鲜剥离的云母片上，使其自然铺展，室温下在空气中自然干燥30 min以形成胶原吸附层［12］。对于中性胶原溶液，为消除溶剂中盐分的干扰，可采用蒸馏水小心冲洗吸附层3次后于空气中自然干燥［13］。

1.3.3.2 AFM样品观察

将样品置于AFM样品台上，室温条件下采用Tapping模式进行观察。AFM探针微悬臂长度为180 μm，针尖曲率半径为10 nm，针尖为商用氮化硅针尖，力常数为2.8 N/m。所有图像只经过自动平滑处理，以消除慢扫描方向上的低频噪音。每个样品随机选取6个不同的区域，每个区域至少进行20次扫描，从而确保得到可重复的高质量的图像。

2 结果与分析

2.1 乙酸缓冲液中刺参体壁PSC的溶液聚集状态

当刺参体壁PSC溶解于pH值2.7的乙酸缓冲液中时，不同样品浓度下的溶液聚集状态如图1所示。由图1可以看出，在较低浓度(0.01 mg/mL)时，刺参体壁酶促溶性胶原蛋白主要以单体形式存在(图1A)，此时，大部分胶原蛋白分子还未开始组装，只是简单的吸附在云母表面。这可能是由于在酸性环境中样品浓度较低时，多肽链上由胶原蛋白分子内肽键的酰胺基和溶液中的H+形成的-NH2+-的相互排斥作用占明显优势。然而，随着样品浓度的增加，多肽链上的疏水作用会逐渐超过排斥作用［14］。当浓度增加到0.05 mg/mL时，胶原蛋白分子逐渐开始进行自组装，形成分散比较均匀的聚集体，但是大多独立存在，未形成广泛交联(图1B)。当浓度进一步增加到0.1 mg/mL后，聚集体纤维之间的交联程度明显增加，逐渐产生横向融合，聚集体直径明显增大，在云母表面组装成如图1(C)～图1(E)中所示的网络结构，并最终形成不规则的团状聚集体(图1F)。

图1 乙酸缓冲液中刺参体壁PSC的溶液聚集状态

2.2 PBS缓冲液中刺参体壁PSC的溶液聚集状态

当刺参体壁PSC溶解于pH值7.2的PBS缓冲液中时，不同样品浓度下的溶液聚集状态如图2所示。由图2可以看出，当样品浓度为0.01 mg/mL和0.05 mg/mL时，刺参体壁酶促溶性胶原蛋白分子的数量极少，在AFM图像中基本观察不到胶原蛋白分子在云母表面的吸附。浓度为0.1～0.5 mg/mL时，胶原蛋白分子开始进行自组装，少数胶原蛋白分子发生聚集，形成不规则的片状聚集体。当浓度进一步增加到1.0 mg/mL时，许多胶原蛋白分子逐渐聚集，呈球形均匀分布在云母表面。而当浓度达到2.0 mg/mL时，胶原蛋白之间逐渐发生融合，形成如图2F所示的片状结构。这与钟朝辉等［15］对鱼鳞胶原蛋白溶液聚集行为研究的结果不同，可能与胶原种类不同有关。

图2 PBS缓冲液中刺参体壁PSC的溶液聚集状态

2.3 超纯水中刺参体壁PSC的溶液聚集状态

当刺参体壁PSC溶解于超纯水中时，样品浓度对胶原溶液聚集状态的影响如图3所示。由图3可以看出，在样品浓度为0.01和0.05 mg/mL时，刺参体壁酶促溶性胶原蛋白分子分布不均匀，部分发生聚集现象。而当浓度为0.1 mg/mL时，胶原蛋白聚集体增多，但在云母表面分布十分均匀。浓度为0.5 mg/mL时，胶原蛋白分子聚集状态加剧，交联程度增加，大部分分子聚集成球形网络结构均匀分布在云母表面。随着浓度的进一步增加，胶原蛋白分子继续聚集，逐渐形成更大的球形结构，并最终变成比较大的无规则堆积结构(图3F)。

比较图2和图3可知，同样接近于pH值7.0，刺参体壁PSC在不同溶剂中的溶液聚集状态明显不同。当刺参体壁PSC溶解于pH值7.2的PBS缓冲液中时，在低浓度范围内(0.01～0.05 mg/mL)基本观察不到胶原蛋白分子的自组装现象，而在超纯水中，即使浓度较低，胶原蛋白分子也很容易形成聚集体。此外，胶原蛋白的溶液聚集状态与其溶解于pH 2.7的乙酸缓冲液中时也有明显区别，这说明刺参体壁PSC的溶液聚集状态与溶剂及其pH值紧密相关。

2.4 加热温度对刺参体壁PSC溶液聚集状态的影响

将刺参体壁PSC溶解于pH值2.7的乙酸缓冲液中，在浓度为0.01 mg/mL、加热时间为0.5 h的条件下，不同加热温度对样品胶原溶液聚集状态的影响如图4所示。

由图4可以看出，加热温度对刺参体壁PSC的溶液聚集状态有显著影响。未经加热时，胶原蛋白分子主要以少数单体形式存在。当温度达到40℃后，胶原蛋白分子发生轻微聚集，形成少量聚集体，但仍孤立存在(图4B)，之后逐渐发生融合，自组装成大量球状聚集体，密布在云母表面。当加热温度超过80℃时，胶原蛋白之间的聚集程度反而下降，网络结构逐渐消失，至120℃时，在云母表面基本观察不到胶原蛋白分子的吸附。这与高温条件下胶原受热变性发生降解，从而导致其结构被破坏有关。

2.5 加热时间对刺参体壁PSC溶液聚集状态的影响

将刺参体壁PSC溶解于pH值2.7的乙酸缓冲液中，在浓度为0.01 mg/mL、加热温度为80℃的条件下，不同加热时间对样品胶原溶液聚集状态的影响如图5所示。

图3 超纯水中刺参体壁PSC的溶液聚集状态

图4 加热温度对刺参体壁PSC溶液聚集状态的影响

由图5可以看出，刺参体壁PSC的溶液聚集状态随加热时间的延长而发生明显的变化。未经加热时，胶原蛋白分子主要以少数单体形式存在。加热0.5 h时，胶原蛋白分子开始发生聚集，但在云母表面的分布并不均匀。随着加热时间的延长，胶原蛋白分子之间交联的程度不断增强，形成直径较大的聚集体，继续延长其加热时间，2.0 h时，胶原蛋白分子间交联程度降低，发生一定程度的降解，分散成数量更多的、分布相对比较均匀的聚集体。

图5 加热时间对刺参体壁PSC溶液聚集状态的影响

3 结论

本文利用AFM考察了样品浓度、溶剂、加热温度及时间对刺参体壁PSC的溶液聚集状态的影响，得出以下结论:

(1)刺参体壁PSC分子有在固体表面自组装的特性。其在溶液中的聚集状态与样品浓度、溶剂密切相关。在pH值2.7乙酸缓冲液、pH值7.2 PBS缓冲液和超纯水中，随着PSC浓度的增加，聚集程度均逐渐加剧，最终形成无规则的线团结构或片状聚集体。但是溶剂不同，PSC分子进行自组装的难易程度不同;

(2)热处理条件达到一定温度和时间后，使刺参体壁PSC的结构发生改变，从而影响其在溶液中的聚集状态。

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Studies on the Aggregation of Pepsin-soluble Collagen from Sea Cucumber Body Wall by AFM

Dong Xiu-ping1，2，Zhu Bei-wei1，2，Qi Li-po3，Zheng Jie2，Zhang Shuang1，Jiang Dan1
1(Dalian Polytechnic University，School of Food Science and Technology，Dalian 116034，China)2(Jiangsu University，School of Food and Biological Engineering，Zhenjiang 212013，China)3(Dalian Kuishi Canned Food Co.，Ltd，Dalian 116101，China)

In order to study the changes of collagen from sea cucumber body wall during heating process，the AFM method was adopted to investigate the influence of sample concentration，solvents，heating processing temperature and heating time on the aggregation states of PSC from sea cucumber body wall.The results showed that in acetate buffer(pH 2.7)，PBS buffer(pH 7.2)and ultra-pure water solution，collagen self－assembled gradually as the concentration increased and net－work of random coils or schistose structure were formed eventually.But the concentration of PSC needed to start self-assemble was different in the solutions mentioned above.The collagen self-assembled gradually to net-work as the heating temperature rised or the heating time prolonged.But，when the temperature was higher than 100℃ or the time was longer than 2 h，its crosslinking degree would decrease and the net－work structure disappeared gradually.

sea cucumber body wall，PSC，AFM，aggregation state

博士研究生(朱蓓薇教授为通讯作者)。

*国家自然科学基金项目(30571449);科技部国际重大合作项目(2006DFA32580);辽宁省教育厅A类项目(2008068)

2010－10－18