中药物质基础研究方法评述Δ

朴胜华，罗朵生（1.广东药学院中医药研究院，广州 510006；2.国家中医药管理局高脂血症调肝重点研究室/国家中医药管理局脂代谢三级实验室，广州 510006）

中药物质基础研究方法评述Δ

朴胜华1，2＊，罗朵生1，2（1.广东药学院中医药研究院，广州 510006；2.国家中医药管理局高脂血症调肝重点研究室/国家中医药管理局脂代谢三级实验室，广州 510006）

目的：探讨中药物质基础研究思路。方法：查阅相关文献，对拆方研究法与整方研究法、代谢研究法与血清药物化学法、中药有效组分模式与谱效关系研究法、分子生物色谱技术与多靶点筛选技术以及系统生物学技术的特点与不足进行总结、分析与比较。结果：上述方法的不足体现在对药效物质的辨识和筛选时脱离了中医药理论，忽视了中药有效成分在体内的动态变化过程。由于现有分析手段的局限性以及定性过程较复杂等原因，限制了上述方法的广泛应用。结论：中药物质基础的研究应依据传统中医药理论，遵循中药的整体性、协同性和多靶点作用特点，最大限度地综合运用现代相关技术去揭示中药复方的物质基础。

中药；物质基础；研究方法；综述

Δ广东省中医药局建设中医药强省科研课题（2008177）

＊副研究员，博士。研究方向：中医药防治代谢紊乱性疾病。电话：020-39352609。E-mail：piaow@163.com

中药物质基础研究是中药研究的难点和重点之一，是中医药现代化研究的重要组成部分，对控制中药质量、阐明有效成分及其作用原理具有重要意义。但由于中药作用的整体性、成分和作用机制的复杂性，使得中药物质基础研究进展缓慢，这已成为制约中药现代化的一个瓶颈[1]。寻找适合中药复杂体系物质基础的研究方法，一直是中药研究的关键问题，并已列入国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006－2020年）、重大新药创制科技重大专项和中医药创新发展规划纲要（2006－2020年）相关领域和主题的重要内容。因此，针对中药物质基础研究的诸多难点，进行方法学创新，发展具有普遍适用意义的中药物质基础研究方法学，将对中药物质基础研究的可持续、高速发展产生巨大的推动作用。本文拟就近年来中药物质基础相关研究方法、特点与不足作一综述。

1 拆方研究法和整方研究法

拆方研究法是以复方的君、臣、佐、使组方原则或功效为主要导向，对复方中药进行筛选。即逐步减去复方中一味或几味中药，拆成单味药或药物组，以观察疗效变化，逐渐缩小研究范围，最终确定必须保留的药物，从中寻找有效成分。拆方法可研究复方的组成原则和配伍作用。近年来，有学者对血府逐瘀汤[2]、吴茱萸汤[3]等进行了拆方研究，发现了具有代表性的有效成分。但拆方法忽视了方药合煎的影响以及成分之间的相互作用。

随着现代分析、分离、鉴定方法与技术的引入，整方研究法在一定程度上克服了拆方法的局限性，在许多复方研究中得以应用。整方研究法是将复方视为一个整体，研究中运用植化方法对复方煎煮后的药液进行系统分离和鉴定，以获得全方化学信息。还可结合单味药成分，分析整方与单味药的区别，发现煎煮等过程中有无新化合物生成等。如，从麻醉复方整方中分离获得东莨菪碱[4]，从白头翁汤中获得生物碱、香豆素、皂苷、柠檬苦素4类化学成分等[5]。但整方中化学成分更加复杂，涉及面更广，工作难度更大。将整方法与拆方法结合运用，有助于中药物质基础的全面阐释。

2 代谢研究法和血清药物化学法

代谢研究法是通过给药后对动物血液、尿、胆汁、胃液、肠液、粪便等进行分离、分析，从而发现复方在体内发挥药效的物质。其中，多集中在研究给药后的动物血液上，即血清药物化学法。

中药复方成分虽复杂，但进入体内且被检测到的化学成分数量有限。进入血液的成分包括复方的原型单体、肠内菌代谢产物，以及它们对机体直接作用后产生的生理活性物质。代谢研究法排除了复方本身复杂理化性质、胃肠中不能进入血清的药物成分等干扰，可更快速地发现有效成分。用代谢研究法对小柴胡汤进行研究后发现，服用小柴胡汤后血浆中发现了原方中没有的一些新化合物，如黄芩苷的新代谢物黄芩苷元硫酸酯等[6]。对茵陈蒿及其复方进行的血清药物化学研究发现，口服给药后，具有促进胆汁分泌作用的6，7-Dimethylesculetin（6，7-DME）被大量吸收入血，其余药物成分可能在其他环节对6，7-DME产生影响，但在血液中并未检出，由此认定，6，7-DME为茵陈蒿和茵陈蒿汤的物质基础[7]。

然而，该法在实际运用中也遇到了较多问题。首先，在血清中检测到的成分可能是无效物质或是有效物质的代谢产物；其次，某些吸收入血检测到的成分，经过富集和提纯后，需比原来血清中的浓度高许多倍时才显示相关药理作用，这给有效成分的确定带来困难。此外，不同种属、年龄的动物对药物吸收的差异，不同给药剂量、采血时间造成的血药成分、浓度的差异，加上血清内源性成分的干扰，给血清有效成分的分离、鉴定造成了较大的困难。因此，中药血清药物化学虽是一种很有发展前途的方法，但许多问题尚待今后更系统深入的探讨。

3 中药有效组分模式和谱效关系研究法

中药有效组分，是指从一味中药或复方中药中提取的一类或几类化学成分的混合体，且这一类或几类已知化学成分被认为是有效组分。与原药材相比，它富集了有效物质。由于中药复方的整体层次过于复杂，而单一成分又常失去中医药的特色，因此有效组分的研究显得尤为重要。

谱效关系是建立在指纹图谱的研究之上，应用色谱及其联用技术，最大限度地获取有用的化学信息。通过对有效组分进行谱效关系研究，将标示活性成分群特征峰的指纹图谱与药效结果对应起来，将中药指纹图谱中化学成分的变化与药效结果联系起来，建立谱效关系，探讨复方的物质基础[8]。如，石钺等[9]利用高效液相色谱和液相色谱-串联质谱提供的色谱和离子碎片信息，对相同试验条件下提取的银翘散中抗流感病毒有效组分及其组方各单味药的指纹图谱流出组分进行对比分析。结果，对银翘散中抗流感病毒有效组分指纹图谱中的30个共有色谱峰，在单味药中归属了其中的29个峰，基本实现了银翘散中抗流感病毒有效组分与其单味药中各组分的归属，确定了该方的物质基础。

4 分子生物色谱技术与多靶点筛选技术

分子生物色谱技术与多靶点筛选技术的基本方法均是针对中药复方多成分调节作用的多靶点特性，通过配体-受体的药物研究理论，进行药效物质的筛选、确定。

分子生物色谱技术包括固定血清蛋白生物色谱、固定生物膜色谱等。其操作过程是将生物体内活性物质如酶、受体、运输蛋白和其他具有重要生理功能的生物大分子固定于色谱填料中，复方提取物通过色谱柱后，经过特异识别、结合和分离，最终被分离和鉴定。如，Wang HL等[10]用人血清白蛋白（HSA）生物色谱技术研究了茵陈蒿的甲醇提取物在色谱柱上的结合状态，发现了5个保留峰，并鉴定出其中的2个化合物分别为滨蒿内酯和茵陈新，说明这2个化合物具有生理活性。Mao X等[11]首先采用固定脂质体柱色谱（ILC）的方法筛选当归中的活性成分，从ILC的色谱图中找到了10个色谱峰，其中2个化合物鉴定为阿魏酸、藁本内酯，二者曾被报道是当归中最重要的有效成分。但该法使用的是自然生物膜，膜受体的密度较小，柱效较低；色谱柱寿命通常比较短，且常受非特异结合因素的干扰，其有效成分并不一定是与受体结合，有可能通过其他形式影响受体的功能，不能完全模拟体内复杂环境，这给有效成分的研究带来很大困难。

以基因、受体、酶等为药物作用靶点的高通量筛选技术在中药有效成分筛选、分离等的研究中发挥了重要作用。Sun X等[12]用细胞外膜片钳技术构建体外培养的皮质神经元模型，筛选了22种中药对N-甲基-D-天冬氨酸受体的拮抗作用。结果显示，黄芩、粉防己、鼠尾草等水提取物能阻断N-甲基-D-天冬氨酸的通路。el-Mekkawy S等[13]以寻找HIV-1受体拮抗药为目标，从灵芝子实体所包含的化合物中发现Ganoderiol F和Ganodermanontriol有抗HIV-1受体的活性。但是高通量筛选的局限性也十分明显，主要表现在该技术不能充分反映药物的全面药理作用，也无全面反映机体生理机能的理想模型。

5 系统生物学技术

系统生物学技术主要研究一个生物系统中所有组成成分如基因、mRNA、蛋白质等的构成，以及在特定条件下这些组分间的相互关系[14]。

复方是在中医药理论指导下治疗疾病的主要应用方式，其疗效是体内多靶点协同作用的综合结果，体现了整体性特点。系统生物学技术在很大程度上符合中药整体性作用特点，为解开复方“黑箱”之谜提供了有力武器。在系统生物学体系中，代谢组学是近年来的研究热点，在研究机体正常状态-疾病-中药这个有机系统时体现了一定的优势。一方面，可研究生命体代谢网络在疾病和中药干预下，所引起的内源性物质代谢的变化或随时间的变化；另一方面，把中药作为一个有机整体，对中药成分在体内的代谢变化情况进行动态跟踪监测、定量和分类。通过比较正常、病理、服药后生命体代谢网络图谱差异，借助化学计量学等手段，将这些代谢信息与病理、生理过程中的生物学事件、中药提取物中的有效成分关联起来，从而确定发生这些变化的靶器官和作用位点，进而确定相关的生物标志物（组），认识疾病的本质，找出中药提取物中的相关物质，揭示中药成分结构-代谢-活性的相关性，阐明中药物质基础和作用机制[15]。代谢组学分析的流程包括样品的制备、数据的采集和数据的分析及解释等。其中分离、分析手段及其组合的应用在代谢组学研究中较为关键，后期还需借助于生物信息学平台进行数据的分析和解释。目前，代谢组学技术主要存在分析手段局限、定性过程复杂、全部组分定量分析难以实现、准确性不足等弊端，这在一定程度上限制了它的广泛应用[16]。

王喜军等[17]将代谢组学应用于茵陈蒿汤的研究，表征了大鼠肝损伤的5个内源性特征生物标记物，茵陈蒿汤对标记物造模后的回调作用明显，说明茵陈蒿汤对肝炎的预防作用显著，从药物代谢组学角度对经典方剂防治肝损伤给出了全新解释。Yu Y等[18]用代谢组学方法寻找耧斗菜中的抗菌活性物质，最终得出Maguoflorine为其抗金黄色葡萄球菌的主要活性成分，并认为耧斗菜的体内作用靶点与林可霉素、氯霉素、链霉素以及四环素的靶点相同。

6 讨论

综上所述，中药物质基础研究经多年的探索努力，已建立了一些有效的方法（如图1）。从研究对象切入点来看，可分为以实验动物为出发点的研究方法，如代谢及血清药物化学研究技术、系统生物学技术等；以中药为出发点的研究方法，包括整方与拆方研究法、有效组分与谱效关系研究法、分子生物色谱及高通量筛选技术等。

但就现状而言，对中药物质基础的研究还不够深入。原因主要有：（1）中药药效物质的辨识和筛选技术脱离了中医药理论，只是简单地引入现代药物化学和药理学等理论和手段，基本走上了“中药西化”的道路，与中医药整体观及多成分、多靶点整体作用特点不甚吻合。如，传统的中药物质基础研究往往遵循先化学分离、后分析鉴定，再结合药理实验以确定主成分的活性导向方法，应用此法虽能阐明很多中药活性成分，但这样的分离、分析操作烦琐、周期长，并且不能完全阐明中药多成分、多靶点的作用特点。（2）中药物质基础的研究没有重视中药有效成分体内的动态变化过程。传统的中药物质基础研究模式重点考察中药中含有哪些成分、哪些成分能在药理实验中显示活性，没有重视其中的化学成分是否能够被吸收以及吸收后在体内的系列变化过程。众所周知，任何药物都是通过与人体的相互作用而发挥疗效的，因此中药物质基础的研究应该紧扣人体对药物的作用，充分考虑中药有效成分在体内的动态变化过程（吸收、分布、代谢、靶向等），阐明体内发挥疗效的真正药效物质基础[19]。（3）中药成分复杂，现有的系统生物学技术仍存在许多不足与弊端。

因此，可依据传统中医药理论，遵循中药的整体性、协同性和多靶点作用特点，借鉴现代化学和生命科学领域的最新技术和方法，如高效液相色谱-二极管阵列-蒸发光散射检测法联用技术、液相-飞行时间质谱联用技术等，从中药活性成分的生成、吸收、分布、靶向作用和代谢的全过程对中药开展系统的研究，建立一种动物体内模拟的中药物质基础筛选新方法（如图2），最大限度地综合运用现代相关技术去揭示中药复方的物质基础。

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A

1001-0408（2012）23-2194-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.23.33

2011-06-21

2011-09-21）