注射用羟基红花黄色素A对大鼠脑神经元线粒体的保护作用研究

徐 露，董 志（重庆医科大学重庆市生化与分子药理重点实验室，重庆 400016）

注射用羟基红花黄色素A对大鼠脑神经元线粒体的保护作用研究

徐 露＊，董 志（重庆医科大学重庆市生化与分子药理重点实验室，重庆 400016）

目的：研究注射用羟基红花黄色素A对大鼠脑神经元线粒体的保护作用。方法：采用线栓法复制大鼠脑缺血再灌注模型，实验分为假手术（等容生理盐水）、模型（等容生理盐水）、尼莫地平（1.0mg·kg－1）和羟基红花黄色素A高、中、低剂量（10.24、5.12、2.56mg·kg－1）组。尾iv给药，每天1次，连续3 d。测定大鼠血清中血小板活化因子（PAF）含量、脑海马组织Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶活性；观察电镜下灰质部位神经元线粒体超微结构。结果：与模型组比较，羟基红花黄色素A高、中、低剂量组大鼠血清中PAF的含量显著降低，海马组织Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶含量显著提高（P＜0.01）；神经元线粒体结构较完整，线粒体的破坏明显比模型组轻。结论：注射用羟基红花黄色素A具有明显的脑线粒体保护作用。

羟基红花黄色素A；线粒体；血小板活化因子

红花是我国传统的活血化瘀良药，主要有效成分是羟基红花黄色素A（Hydroxysafflor yellow A，HSYA），其不仅是一种药物，也是一种食品和染料。羟基红花黄色素A只能通过静脉给药，在临床上治疗各种缺血性心脑血管疾病，效果良好，但作用机制不甚明确。本文拟将注射用羟基红花黄色素A的神经保护作用机制做一个初步分析，旨在为临床应用提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Hitachi-7500透射电镜（日本日立公司）；722型分光光度计（中国科技研究院）。

1.2 试药

注射用羟基红花黄色素A（浙江永宁药业股份有限公司，批号：20100305，含量：每瓶含量为85%）；尼莫地平注射液（天津药业集团新郑股份有限公司，批号：20100118）；三磷酸腺苷（ATP）酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）；血小板活化因子（PAF）Elisa试剂盒（武汉中美科技有限公司，批号：20100319）。

1.3 动物

清洁级SD大鼠，♀♂兼用，体重200～250 g，由重庆医科大学实验动物中心提供（动物使用合格证号：SCXK（渝）20020001）。

2 方法

2.1 复制模型

采用线栓法复制大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。10%水合氯醛，按1m L·100 g－1ip麻醉大鼠。颈部正中切口，分离右颈总动脉与颈内、颈外动脉。在距颈动脉分叉5mm处，双线结扎颈外动脉，颈内动脉穿线备用，结扎右颈总动脉的近心端。在靠近动脉分叉的颈总动脉壁上剪一小口，插入一直径为0.2mm的尼龙线（尼龙线头端用石蜡薄薄地包裹），经颈内动脉进入大脑中动脉起始部，以阻断大脑中动脉的血流。插入线长约16mm时，有明显阻力感。结扎颈内动脉与尼龙线，防止插线脱落。假手术组除不插入尼龙线外其他手术步骤同手术组。缺血30m in后，缓慢拔出栓子约10mm，剪断线栓外露部分，扎紧活结，使血流恢复成再灌注状态。

2.2 分组与给药

将60只大鼠随机分为6组，即假手术（等容量生理盐水）、模型（等容量生理盐水）、尼莫地平（1.0mg·kg－1）和羟基红花黄色素A高、中、低剂量（10.24、5.12、2.56mg·kg－1）组。各组均于缺血再灌注后2 h尾iv给药，每天1次，连续3 d。

2.3 PAF含量检测

手术前大鼠颈动脉取血0.5m L，最后一次给药后12 h，大鼠眼眶取血0.5m L，室温放置1 h后取血清，严格按照试剂盒步骤检测PAF含量水平。

2.4 ATP酶含量检测

将海马组织制成10%的匀浆，2 000 r·m in－1离心10m in，取上清液，1 000 r·min－1离心15min，沉淀物即为线粒体。用Low ry法进行蛋白定量，经检测证实制备的线粒体纯度较高。将分离的线粒体用冰冷的匀浆介质制成混悬液，超声波粉碎法破碎线粒体，测定Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶含量。

2.5 电镜样品的制备

将各组大鼠用4%的戊二醛心脏灌流固定，快速取出缺血侧大脑皮层，切成1mm3小块，置于4%的戊二醛电镜液中固定，按照电镜样品制备程序漂洗、脱水、浸透与环氧树脂包埋，超薄切片后，将切片捞至铜网上，干燥后进行铅铀双染。透射电镜下观察网孔中细胞形态及其超微结构的改变并摄片。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 PAF含量检测结果

与假手术组比较，模型组大鼠血清中PAF含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，羟基红花黄色素A高、中、低剂量组大鼠血清中PAF含量显著降低（P＜0.01或P＜0.05）。PAF含量检测结果见表1。

表1 PAF含量检测结果（±s，n＝10）Tab 1 Resultsof content determ ination of PAF（±s，n＝10）

表1 PAF含量检测结果（±s，n＝10）Tab 1 Resultsof content determ ination of PAF（±s，n＝10）

与假手术组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.sham operation group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

给药后0.59±0.05 2.36±0.28＊1.66±0.85# 1.17±0.33## 1.35±0.24## 1.41±0.39## n组别假手术组模型组尼莫地平组羟基红花黄色素A高剂量组羟基红花黄色素A中剂量组羟基红花黄色素A低剂量组10 10 10 10 10 10 PAF含量/ng·mL－1给药前0.64±0.07 0.55±0.04 0.72±0.10 0.60±0.09 0.74±0.15 0.68±0.12

3.2 ATP酶活力比较

与假手术组比较，模型组大鼠海马线粒体的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶活性显著减弱（P＜0.01）；与模型组比较，羟基红花黄色素A高、中、低剂量组大鼠海马线粒体的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶活性显著增强（P＜0.01）。ATP酶活力检测结果见表2。

表2 ATP酶活力检测结果（±s，n＝10）Tab 2 Resultsof theactivity of ATPenzyme（±s，n＝10）

表2 ATP酶活力检测结果（±s，n＝10）Tab 2 Resultsof theactivity of ATPenzyme（±s，n＝10）

与假手术组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.01vs.sham operation group：＊P＜0.01；vs.modelgroup：#P＜0.01

组别假手术组模型组尼莫地平组羟基红花黄色素A高剂量组羟基红花黄色素A中剂量组羟基红花黄色素A低剂量组Mg2+-ATP酶/μmol·mg-1 3.74±0.15 2.54±0.07＊3.30±0.18# 3.53±0.14# 3.38±0.13# 3.29±0.16# n 10 10 10 10 10 10 Na+-K+-ATP酶/μmol·mg-1 3.88±0.17 2.67±0.09＊3.16±0.13# 3.55±0.18# 3.62±0.16# 3.40±0.15# Ca2+-ATP酶/μmol·mg-1 2.57±0.08 1.23±0.05＊1.89±0.06# 2.24±0.10# 2.05±0.09# 2.16±0.12#

3.3 电镜观察结果

假手术组可见正常的杆状线粒体，椭圆形，结构完整，形态均匀，分布有序，嵴丰富；模型组可见神经元坏死，线粒体数量减少，明显肿胀、空泡化，嵴排列不规则甚至断裂；羟基红花黄色素A高、中、低剂量组线粒体损伤较模型组明显减轻，线粒体结构较为清晰，肿胀或变形较不明显，基质中无空泡，内膜较为完整。电镜观察结果见图1。

4 讨论

PAF是一种炎症因子，许多炎性细胞如肥大细胞、碱性粒细胞、中性粒细胞与血小板等均可合成和释放PAF。目前，国内、外已经有大量文献报道，在各种缺血性心脑血管疾病、哮喘、溃疡等患者当中，血清PAF含量较正常人有显著升高，尤其在疾病发生的急性期，PAF含量升高最快。本研究发现，与模型组比较，高、中、低剂量注射用羟基红花黄色素A均能降低MCAO模型大鼠手术后血清PAF含量，提示其具有一定的抗炎作用[1，2]。

图1 电镜观察结果（20 000×）A.假手术组；B.模型组；C.尼莫地平组；D.羟基红花黄色素A高剂量组；E.羟基红花黄色素A中剂量组；F.羟基红花黄色素A低剂量组Fig 1 resultsof electronm icroscope（20 000×）A.sham operation group；B.model group；C.nimodipine group；D. HSYA high-dose group；E.HSYA medium-dose group；F.HSYA low-dosegroup

ATP酶存在于组织细胞与细胞器膜上，是生物膜上的蛋白酶，在物质运输、能量转换以及信息传递方面具有重要作用。机体在缺氧与一些疾病状态下，此酶活力会发生一系列改变，膜上各种离子泵（Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶）的泵功能失调，细胞内、外离子失衡，造成细胞内Na+、Ca2+大量聚集，细胞水肿，甚至死亡。注射用羟基红花黄色素A能够显著提高海马区域的线粒体ATP酶含量，改善线粒体ATP酶活性，保障能量代谢的顺利进行，从而减轻神经元的损伤。从线粒体的超微结构上来看，羟基红花黄色素A可改善MCAO模型大鼠脑组织线粒体的超微结构，可能与线粒体ATP酶活性的提高从而更好地维持细胞结构有关[3，4]。

综上所述，注射用羟基红花黄色素A能够有效减少MCAO模型大鼠的炎症因子PAF含量水平，减轻炎症，提高线粒体ATP酶活性，维持正常的线粒体结构，从而达到神经保护效果。

[1] Jiang X，ShiE，Nakajima Y，etal.Posteonditioning，aseries of brief intem iptions of early reperfusion，prevents neurologic injury after spinal cord ischem ia[J].Ann Surg，2006，244（1）：145.

[2] Blecharz-Klin K，Piechal A，Joniec I，et al.Pharmacological and biochem ical effects ofGinkgo bilobaextract on learning，memory consolidation and motor activity in old rats[J].Acta Neurobiol Exp（Wars），2009，69（2）：217.

[3] Nishida Y，Ito S，OhtsukiS，etal.Depletion of vitamin E increases abeta accumulation by decreasing its clearances from brain and blood in amousemodel of A lzheimer disease[J].JBiolChem，2009，284（48）：33 400.

[4] 赵淑敏，刘 胜，杨宏光，等.黄芩叶总黄酮预处理对缺血再灌注心肌脂质过氧化损伤的保护作用[J].解剖学杂志，2006，29（4）：450.

Protective Effect of HSYA Freeze-dried Powder on Brain Neuronal M itochondria of Rats

XU Lu，DONG Zhi（Chongqing Key Laboratory of Biochem istry and Molecular Pharmacology，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

OBJECTIVE：To study the protective effect of HSYA freeze-dried powder on brain neuronalmitochondria of rats. METHODS：Cerebral ischemia-reperfusion modelwas induced by suturemethod.Model rats were divided into 5 groups，i.e.sham operation group（constant volume normal saline），model group（constant volume normal saline），nimodipine group（1.0mg·kg－1），HSYA high-dose，medium-dose and low-dose groups（10.24 mg·kg－1，5.12 mg·kg－1，2.56 mg·kg－1）.They were given relevant drugs intravenously via tail once a day for consecutive 3 days.The content of PAF in serum and the activity of Na+-K+-ATP enzyme，Ca2+-ATP enzyme and Mg2+-ATP enzyeme in hippocampus were all determined.We observed ultrastructure of mitochondrial in gray area w ith electron m icroscope.RESULTS：Compared w ith model group，the content of PAF in serum of HSYA high-dose，medium-dose and low-dose groups could decrease significantly，and the activity of Na+-K+-ATP enzyme，Ca2+-ATP enzyme and Mg2+-ATP enzyme in hippocampus could increase significantly（P＜0.01）.M itochondrial structure wasmore complete and mitochondrial damaging in HSYA groups was slighter than that in model group.CONCLUSION：HSYA freeze-dried powder has a significant protective effect on brain m itochondria.

HSYA；M itochondria；PAF

R285.5；R97

A

1001-0408（2012）23-2127-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.23.06

＊助理研究员，硕士。研究方向：新药研发。E-mail：xulu62@163. com

2011-06-19

2011-10-28）