黄连中原小檗型生物碱的分离与鉴定Δ

黄连中原小檗型生物碱的分离与鉴定Δ

王 欣1＊，武小赟2，黄彦珺2，李铁钢2，张 艺2，罗维早1#（1.重庆市中药研究院，重庆 400065；2.成都中医药大学，成都 611730）

目的：研究黄连中的原小檗型生物碱成分。方法：采用溶剂提取、色谱分离等手段对样品进行分离、纯化，根据波谱数据进行化合物结构鉴定。结果：从黄连中分离出6个生物碱成分，分别鉴定为盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸药根碱、盐酸非洲防己碱、盐酸表小檗碱、盐酸巴马汀。结论：该方法简单、可行，可为黄连药材及其制剂的质量标准提供对照品。本试验为首次采用直接分离纯化的方法从黄连中得到盐酸表小檗碱。

黄连；原小檗型生物碱；分离；鉴定；盐酸表小檗碱

Δ国家科技支撑计划项目（2007BAI40B03）；《中国药典》2010版一部标准研究课题（YZ-251、YZ-252、YZ-253）

＊助理研究员，硕士。研究方向：中药化学。电话：023-89029031。E-mail：wangxin_cq386@sina.com

#通讯作者：研究员。研究方向：中药化学及新剂型。电话：023-89029026。E-mai:loweizao@163.com

黄连始载于《神农本草经》，系毛茛科植物黄连Coptis chinensisFranch.、三角叶黄连C.deltoideaC.Y.Cheng etHsiao或云连C.teetaWall.的干燥根茎。其化学成分主要为异喹啉类生物碱，其中小檗碱含量最高；其次为黄连碱、巴马汀、药根碱、木兰碱、表小檗碱、甲基黄连碱、非洲防己碱等；此外，还含有阿魏酸、绿原酸、3，4-二羟基苯乙醇葡萄糖苷等酚性成分和钾、磷、镁、钠等多种无机元素及多糖成分[1、2]。

黄连中生物碱均为异喹啉类生物碱，其化学结构母核相同，仅母核上取代基不同，结构差异极小，理化性质也极其相似，分离纯化难度极大；尤其是表小檗碱、黄连碱、非洲防己碱纯品制备难度大，对照品奇缺。小檗碱虽是黄连的活性成分之一，但在黄柏、三棵针、十大功劳、唐松草等植物中都存在，故仅以小檗碱作为黄连药材、饮片及其制剂的质量控制指标成分，客观性和专属性较差；而生物碱是黄连的有效成分，除小檗碱之外，黄连药材中还有一些含量相对较高的成分，如黄连碱、巴马亭、药根碱、表小檗碱等，特别是黄连碱和表小檗碱可作为甄别黄连与其他掺假品的指标性成分。李信炯等[3]采用碘化物衍生化法从黄连中分离得到表小檗碱碘化物，未直接得到表小檗碱；而笔者首次采用直接分离纯化的方法从黄连中得到了盐酸表小檗碱。本试验旨在对黄连中几种主要生物碱（见图1）的分离、纯化方法进行研究，得到各生物碱单体，为黄连药材及其制剂的质量标准提供对照品[4～6]。

图1 黄连中主要生物碱结构Fig 1 Structure ofmain alkaloids from Rhizoma Coptidis

1 仪器与试药

Melting Point B-540型熔点仪（瑞士Buchi公司）；Mercury Plus-400型核磁共振谱仪（美国Varian公司，TMS为内标）；AutoSpec 3000型质谱仪（美国VG公司）；FTIR-8700型红外光谱仪（日本Shimadzu公司）。

反相C18硅胶填料（60μm，日本DAISO公司）；预制硅胶板（青岛谱科分离材料有限公司）；所用试剂均为分析纯。黄连药材于2007年10月购于重庆石柱，经重庆市中药研究院钟国跃研究员鉴定为毛茛科植物黄连C.chinensisFranch.的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 提取与分离

取黄连根茎粗粉（干重15 kg），依次用8～10倍95%乙醇、60%乙醇、30%乙醇、0.5%硫酸水溶液渗漉，分别减压回收乙醇，浓缩至适量，合并浓缩液，用热水溶解，80℃保温，盐酸调pH值至2～3，放置过夜。过滤后得母液A，加入活性炭于80℃保温30℃后脱色、过滤，备用；沉淀A用95%乙醇溶解，加入活性炭于80℃保温30m in，趁热过滤，得沉淀A重结晶液，适量浓缩，90℃保温30m in，趁热抽滤，抽滤后的液体为母液B，不溶物为沉淀B。母液B用95%乙醇重结晶，得结晶1；沉淀B用50%乙腈重结晶，得结晶2；母液A脱色液与母液B及沉淀B的去结晶后的母液B合并。合并液挥尽有机溶剂，浓缩至适量，用石灰乳调pH值至9，80℃保温30m in，趁热抽滤，滤液用盐酸调pH值至5～6，浓缩至适量，上D101型大孔树脂柱，依次用水、20%乙醇、40%乙醇洗脱，合并乙醇洗脱液，减压回收至无醇味，适量水溶解分散，上C18反相硅胶柱，用乙腈-水（0.5∶9.5→9∶1）梯度洗脱，反复层析，按色带收集洗脱液，用50%乙腈和95%乙醇反复重结晶，分别得结晶1（850.93 g）、2（111.88 g）、3（12.24 g）、4（14.88 g）、5（34.32 g）、6（80.60 g）。黄连生物碱的提取分离流程见图2。

图2 黄连生物碱的提取分离流程Fig 2 Extraction and isolation processof alkaloids from Rhizoma Coptidis

2.2 生物碱的鉴定

结晶1：淡黄色针状结晶，易溶于热水，微溶于冷水、冷乙醇，几乎不溶于氯仿和乙醚；熔点：204.8～205.4℃；UVλCH3OHmax：350，265，229 nm；IR｛KBrmax（cm－1）：3 402，2 997，1 504，1 363；1H-NMR（CD3OD）δ：3.30（2H，t，J＝6.3 Hz，H-2），4.08（3H，s，H-20，OCH3），4.19（3H，s，H-19，CH3），4.85（2H，t，J＝15.4 Hz，H-1），6.08（2H，s，H-15），6.93-9.75（6H，Ar-H）；FAB-MS（m/z）：336 [M]+；采用高效液相色谱（HPLC）法检测纯度＞98%。

结晶2：橙黄色针状结晶，极难溶于水，微溶于乙醇、甲醇；290℃完全炭化，400℃也不熔；UVλCH3OHmax：360，265，241 nm；IR｛KBrmax（cm－1）：3 365，3 004，1 604，1 323；1H-NMR（CD3OD）δ： 3.25（2H，brs，C6H2），4.89（2H，br s，C5H2），6.10（2H，s，C2，3-OCH2O-），6.46（2H，s，C9，10-OCH2O-），6.95（1H，s，C4H），7.64（1H，s，C1H），7.87（2H，s，C11，12H），8.73（1H，s，C13H），9.72（1H，s，C8H）；FAB-MS（m/z）：320[M]+；采用HPLC法检测纯度＞98%。

结晶3：橙色针状结晶，溶于水、乙醇、甲醇，不溶于氯仿；熔点：212.2～212.9℃；UVλCH3OHmax：350，265，239 nm；IR｛KBrmax（cm－1）：3 734，3 341，1 634，1 533，1 444，1 361；1H-NMR（CD3OD）δ：3.20（2H，t，J＝6.3 Hz，H-2），4.88（2H，m，H-1），6.84（1H，s，H-3），7.63（1H，s，H-6），7.98（1H，d，J＝9.15 Hz，H-8），8.07（1H，d，J＝9.2 Hz，H-9），8.76（1H，s，H-7），9.72（1H，s，H-12）；FAB-MS（m/z）：338[M]+；采用HPLC法检测纯度＞98%。

结晶4：橙黄色结晶粉末，溶于水、乙醇、甲醇，不溶于氯仿；熔点：243.1～244.0℃；UVλCH3OHmax：227，266，349，430 nm； IR｛KmBaxr（cm－1）：3 390，1 635，1 605，1 564，1 508；1H-NMR（CD3OD）δ：9.74（1H，s，H-8），8.63（1H，s，H-13），8.08（1H，d，J＝9.0 Hz，H-11），8.00（1H，d，J＝9.2 Hz，H-12），7.55（1H，s，H-1），7.01（1H，s，H-4），4.92（2H，t，J＝6.0 Hz，H-6），4.20（3H，s，9-OCH3），4.10（3H，s，10-OCH3），3.96（3H，s，2-OCH3），3.30（2H，t，J＝6.0Hz，H-5）；FAB-MS（m/z）：338[M]+；采用HPLC法检测纯度＞98%。

结晶5：橙红色针状结晶，溶于水、乙醇、甲醇，不溶于氯仿；熔点：266.0～267.5℃；UVλCmHa3xOH：359，265，243 nm；IR｛KmBaxr（cm－1）：3 327，2 929，1 604，1 359；1H-NMR（CD3OD）δ：3.30（2H，t，J＝6.3 Hz，H-2），3.94（2H，t，J＝15.4 Hz，H-1），4.88（2H，s，H-15），6.46～9.71（6H，Ar-H）；FAB-MS（m/z）：336[M]+；采用HPLC法检测纯度＞98%。

结晶6：黄色针晶（95%乙醇重结晶），溶于冷水，易溶于热水，微溶于乙醇，几乎不溶于氯仿和乙醚；熔点：208.0～208.8℃；UVλCmHa3xOH：348，266，227 nm；IR｛KmBa（xrcm－1）：3 647，3 354（-OH），1 605，1 510，1 458，1 364；1H-NMR（CD3OD）δ：3.27（2H，m，H-2），4.93（2H，t，J＝6.3 Hz，H-1），7.03（1H，s，H-3），7.62（1H，s，H-6），8.01（1H，d，J＝9.2 Hz，H-8），8.09（1H，s，J＝9.2 Hz，H-9），8.79（1H，s，H-7），9.75（1H，s，H-12）；FAB-MS（m/z）：352 [M]+；采用HPLC法检测纯度＞98%。

将波谱数据与文献报道[7～11]数据相比较，可知结晶1、2、3、4、5、6依次为盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸药根碱、盐酸非洲防己碱、盐酸表小檗碱、盐酸巴马汀。

3 讨论

用95%乙醇、60%乙醇、30%乙醇、酸水梯度渗漉，可使黄连中的生物碱提取充分。其中，酸水选择用0.5%的硫酸水溶液，使小檗碱转变成硫酸盐而溶出，但硫酸水溶液浓度不易过高，否则会导致小檗碱硫酸盐转化为硫酸氢盐，反而降低小檗碱的收率[12]。再用盐酸调节pH值，使硫酸盐转变为盐酸盐，降低了溶解度，使小檗碱容易析出。小檗碱具有α-羟胺结构，能形成醇胺型、季铵型、醛型3种互变结构，其中季铵型小檗碱最稳定，在水中溶解度最大。若碱性过强，季铵型小檗碱将转变为醇胺型或醛型小檗碱，而醇胺型或醛型小檗碱的亲脂性强，难溶于水。当石灰乳调pH值过高时，就会造成小檗碱由季铵型转变成醇胺型或醛型分子，降低其提取率。因此，石灰乳调pH值是除杂的关键点。黄连中的水溶性杂质黏度大，妨碍生物碱的结晶，应除去，而采用D101型大孔树脂能除去黄连中的水溶性杂质。

本研究首次使用C18反相硅胶柱进行黄连生物碱的分离，主要是考虑到季胺型生物碱极性大，正相硅胶层析柱载样量小，难分离。试验结果表明，C18反相硅胶柱分离效果较好，但仍需多次分离，若上样量和洗脱梯度控制恰当，能达到较理想的分离效果。

通过HPLC法测定本试验得到的盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸药根碱、盐酸非洲防己碱、盐酸表小檗碱、盐酸巴马汀的纯度，用归一化法计算得纯度均达到98%以上，可作为黄连药材及其制剂质量标准研究的对照品。

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Study on Isolation and Identification ofA lkaloidsof Protoberberine from Rhizoma Coptidis

WANG Xin，LUOWei-zao（Chongqing Academy of Chinese Materia Medica，Chongqing 400065，China）
WU Xiao-yun，HUANG Yan-jun，LITie-gang，ZHANG Yi（Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611730，China）

OBJECTIVE：To study the alkaloids of protoberberine from Rhizoma Coptidis.METHODS：Samples were isolated and purified by means of solvent extraction and column chromatography，and their structures were identified by spectral analyses. RESULTS：Six alkaloids were isolated and identified.The alkaloids were berberine hydrochloride，coptisine hydrochloride，jatrorrhizine hydrochloride，columbam ine hydrochloride，epiberberine hydrochloride，and palmatine hydrochloride.CONCLUSION：The method is simple and feasible，and can provide standards for studying medicinal herbs of Rhizoma Coptidis and its preparations. Epiberberine hydrochloride and directly isolated from Rhizoma Coptidis for the first time.

Rhizoma Coptidis；A lkaloids of protoberberine；Isolation；Identification；Epiberberine hydrochloride

R284.1；R284.2

A

1001-0408（2012）23-2149-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.23.14

2011-06-12

2011-12-30）