海芦笋多糖超声波辅助提取工艺及抗氧化活性研究

王 超 甄润英

（天津农学院食品科学系，天津 300384）

大量研究［1，2］表明，多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗溃疡、抗衰老、降血脂等多种生理活性，因此多糖的提取具有广泛的市场前景和应用前景。多糖的提取方法很多，主要有常规水提法、酶法提取及溶剂提取法，常规的水浸提所需生产时间长、能耗高；酶法提取也存在成本高的问题［3］。植物细胞壁比较坚固，妨碍多糖的提取，一般在提取前要进行专门的破细胞操作［4］。超声波处理是一种物理破碎的过程，超声波是利用机械振动产生的能量，使媒质结构发生空间变化，促使有效成分快速进入溶剂中，同时，超声波产生的空化效应又进一步破坏媒质的细胞壁结构，促使媒质细胞内的有效成分得以释放，直接进入溶剂并充分混合，从而提高提取效果［5，6］。将超声波技术用于天然植物活性成分的提取辅助手段，可以缩短提取时间，减少溶剂用量，提取率也有明显的提高，凡此种种优势，使得超声波技术近年来被广泛应用于很多提取工艺中［7，8］。

海芦笋（Salicornia）又称海篷子，又名石刁柏，为黎科茎肉质化真盐生植物，原产于美洲盐沼地。目前，在中国辽宁、河北、山西、陕西、宁夏、甘肃、山东、江苏等省区均有种植。海芦笋是一种碱性作物，利用天然海水灌溉种植，不使用农药、化肥，是一种纯天然新型有机蔬菜，具有独特鲜美的风味，享有“植物海鲜”的美誉［9，10］。另外，海芦笋还是一种典型的碱性食品，含氨基酸、蛋白质、多糖和黄酮等活性物质具有较高药用和保健价值，可降低胆固醇，对提高人体免疫力及预防帕金森病具有明显的作用，具有良好的减肥效果，对糖尿病、肥胖症、癌症、心血管等疾病也具有一定的预防作用［11，12］。因此，海芦笋是一种开发前景十分广阔的植物。由于中国引种海芦笋时间不长，对海芦笋的研究多集中于引种栽培，而对海芦笋中活性成分的研究相对较少，尤其是海芦笋多糖的研究鲜见报道。

本试验以水为提取剂，对海芦笋多糖超声波辅助提取条件进行研究，同时采用体外抗氧化试验确定海芦笋多糖的抗氧化活性，为海芦笋多糖功能食品、海芦笋多糖类药物的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海芦笋：采集海芦笋鲜叶（采自天津农学院试验田），自然干燥或于60℃左右烘箱中干燥至水分含量8%后粉碎，过40目筛，备用。

葡萄糖、苯酚、浓硫酸、无水乙醇、H2O2溶液、FeSO4、水杨酸、抗坏血酸等：分析纯，市售。

1.2 仪器设备

超声－微波协同萃取仪：CW－2000型，上海新拓微波溶样测试技术有限公司；

旋转蒸发仪：RE－2000型，上海亚荣生化仪器厂；

可见分光光度计：WFJ7200型，尤尼柯（上海）仪器有限公司；

低速离心机：LD5－2B型，北京雷勃尔离心机有限公司；

冷冻干燥机：FD－1A－50型，北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取工艺流程

海芦笋→热风干燥后粉碎→超声波处理→热水浸提→4 000r／min离心10min→取上清液→浓缩至50%→1∶3（V∶V）醇沉→4 000r／min离心15min取沉淀→冷冻干燥→粗多糖成品

1.3.2 超声波辅助提取条件的单因素试验设计 分别考察超声波处理时间、浸提时间、浸提温度、料液比对多糖提取效果的影响。

（1）超声波处理时间的影响：分别称取5g海芦笋干粉5份，按料液比为1∶20（m∶V）加入蒸馏水100mL，分别超声波处理5，10，20，30，40，50min后，置于60 ℃下浸提2h，按方法1.3.1制得粗多糖，并测定多糖含量。

（2）浸提时间对多糖提取率的影响：分别称取5g海芦笋干粉5份，按料液比为1∶20（m∶V）加入蒸馏水100mL，超声波处理10min，于60℃下，分别浸提时间1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h，按方法1.3.1制得粗多糖，并测定多糖含量。

（3）浸提温度对多糖提取率的影响：分别称取5g海芦笋干粉5 份，按料液比为1∶20（m∶V），超声波处理10 min，分别于40，50，60，70，80 ℃下浸提2h，按方法1.3.1制得粗多糖，并测定多糖含量。

（4）料液比对多糖提取率的影响试验：分别称取5g海芦笋干粉5 份，按料液比1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25（m∶V），超声波处理10min，浸提温度为70℃，浸提时间为2h，按方法1.3.1制得粗多糖，并测定多糖含量。

1.3.3 超声波辅助提取条件的优化试验 根据单因素试验结果，以超声波处理时间、浸提时间、浸提温度、料液比为因素，设计了4因素3水平的正交试验L9（34）。

1.3.4 海芦笋多糖传统水提工艺 称取5g海芦笋干粉，按料液比为1∶15（m∶V）加入蒸馏水，置于70℃下浸提1.5，2.0，2.5，3.0，3.5h，按方法1.3.1制得粗多糖，并测定多糖含量。

1.3.5 多糖含量的测定 采用苯酚－硫酸法测定多糖含量。多糖提取率按式（1）计算。

1.3.6 多糖抗氧化活性试验方法 多糖体外抗氧化活性的测定采用改进的水杨酸法［13］，以抗坏血酸作为阳性对照。根据H2O2＋Fe →2＋·OH＋H2O＋Fe3＋，羟自由基氧化水杨酸得到2，3－二羟基苯甲酸，在510nm 处有最大吸收峰，吸光度与羟自由基（·OH）的量成正比。在反应体系中加入羟自由基（·OH）清除剂后，被氧化的水杨酸减少，吸光度变小。

首先在反应体系中加入9mmol／L 的FeSO4、9mmol／L的水杨酸－乙醇，以及不同浓度的供试样品试液各1mL，最后加入8.8mmol／L H2O20.03mL，再启动反应。测得加入样品试液后的吸光度；以1mL去离子水代替供试样品试液，作为空白对照吸光度。每个浓度组平行测定3 次，取平均值，测定结果以清除率表示。清除率按式（2）计算。

利用Origin软件计算提取物对羟自由基的半数抑制率（IC50）。

2 结果与分析

2.1 超声波处理时间对多糖提取率的影响

超声波处理时间对多糖提取率的影响见图1。由图1可知，在超声波处理10 min时，海芦笋多糖提取率较高，超过10min后提取率先下降后上升，在超声波处理40 min时再次出现峰值，之后随着处理时间的延长提取率降低。可能是由于超声波作用过程中，多糖先析出后被重新吸附导致多糖提取量出现波动，且超声波处理时间延长，处理液温度升高，可能会导致多糖的降解。因此，综合考虑能源、提取效率及得率等问题，在正交试验中采用5，10，15min的超声波处理时间进行提取。

图1 超声波处理时间对海芦笋多糖提取率的影响Figure 1 Effect of ultrasonic treatment time on the extraction rate

2.2 浸提时间对多糖提取率的影响

浸提时间对多糖提取率的影响见图2。由图2可知，海芦笋多糖提取率随着浸提时间的增加呈先增加后减少的趋势，提取时间2h时，多糖提取率最大。可能由于在试验条件下浸提温度较高，处理时间过长使得粗多糖中的糖蛋白组分缓慢变性析出，加之后期的高速离心使糖蛋白以不溶的沉淀状物质分离出来［14］；另外随浸提时间的延长可能还会造成多糖的逐渐降解。

图2 提取时间对多糖提取率的影响Figure 2 Effect of extract time on the extraction rate

2.3 浸提温度对多糖提取率的影响

浸提温度对多糖提取率的影响见图3。由图3可知，随着温度的升高，海芦笋多糖提取率逐渐提高。一般来说，提取温度的提高，就会增加溶剂分子和溶质分子的运动，促进扩散作用，从而有利于提高提取率，但是温度过高有可能破坏有效成分，降低多糖活性，蛋白质等杂质的提出也将增加，会对后续处理带来不便［15］。所以在试验中应在正确分析经济效益的基础上，选用合理的浸提温度。试验中还发现，浸提温度从70 ℃上升至80 ℃，多糖的提取率变化并不明显，由4.35%上升到4.40%，因此，在正交试验中，浸提温度选择50，60，70 ℃。

图3 提取温度对多糖提取率的影响Figure 3 Effect of temperature on the extraction rate

2.4 料液比对多糖提取率的影响

料液比对多糖提取率的影响见图4。由图4可知，海芦笋多糖提取率随料液比的增加呈先增加后减少的趋势，当料液比为1∶15（m∶V）时，多糖提取率最大。主要是由于液固两相存在溶解平衡和吸附平衡，低温有利于吸附，当料液比增大时，产生相同热量的条件下，提取液的温度下降，吸附作用增强导致提取率下降［16］。

图4 料液比对多糖提取率的影响Figure 4 Effect of solid／liquid on the extraction rate

2.5 正交试验结果及验证实验

2.5.1 正交试验结果 正交试验L9（34）试验因素、水平及试验结果见表1和表2。

表1 正交设计因子和水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal design

表2 正交试验结果与分析Table 2 The results of the orthogonal test

由表2极差分析得出，影响海芦笋多糖提取率的因素顺序为浸提温度＞料液比＞超声波时间＞浸提时间，最优提取工艺条件为C3D2A3B2，即：浸提温度70 ℃，料液比1∶15（m∶V），超声波处理15min，浸提时间2h。

2.5.2 验证实验 以最优组合进行5次重复性实验，多糖的提取率分别为6.20%，6.12%，6.13%，6.15%，6.00%，平均提取率为6.12%。

本试验在正交试验得到的最佳温度（70 ℃）、最佳料液比（1∶15（m∶V））条件下，采用传统浸提法提取2h，海芦笋多糖的提取率仅为4.42%。由此可见，超声波辅助提取可以用于海芦笋多糖的工业化生产中。

2.6 多糖提取物对羟自由基的清除作用

不同浓度海芦笋多糖提取物和抗坏血酸对羟自由基清除作用见图5、图6。

图5 多糖提取物对羟自由基清除率的影响Figure 5 Effect of the extract on the on hydroxyl radical scavenging tracts

图6 抗坏血酸对羟自由基清除率的影响Figure 6 Effect of the extract on the on ascorbic acid radical scavenging tracts

由图5、图6可知，海芦笋多糖及抗坏血酸对羟自由基的清除作用均随着其浓度的增加而逐渐增强，经计算二者清除羟自由基的IC50分别为0.578，0.060mg／mL，海芦笋多糖对羟自由基的清除能力大约是抗坏血酸的1／10。在相对较低的浓度下，海芦笋多糖及抗坏血酸对羟自由基的清除作用随着其浓度的增加而明显增强，但当达到一定浓度后（海芦笋多糖为2mg／mL、抗坏血酸为0.12 mg／mL）对羟自由基的清除效果趋于平缓。因此，如果作为天然抗氧化剂在实际生产中应用时，要选择适宜的剂量范围，以达到最佳的抗氧化效果。

3 结论

以水为提取剂，通过超声波辅助提取方法，筛选出海芦笋多糖的最优提取工艺，在此工艺下海芦笋粗多糖提取率为6.12%，明显高于传统浸提法。海芦笋多糖对羟自由基（·OH）具有明显的清除作用，清除效果随着多糖浓度增加而增强，由此可知，海芦笋多糖具有一定的抗氧化性。由于试验条件等因素的约束，对多糖的构象未能给出结论，有待以后进一步研究。

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