盐酸阿霉素壳聚糖纳米粒大鼠鼻腔给药的脑内药动学研究

王丛瑶，郑杭生，谷满仓，陈苹苹，金 滔，李范珠

(浙江中医药大学药学院，浙江杭州 310053)

盐酸阿霉素(adriamycin hydrochloride，ADM)属蒽环类抗肿瘤抗生素，具有抗癌谱广、活性强、疗效确切等优点，近年来临床研究发现其对脑胶质瘤亦具有较好的疗效［1］。目前ADM临床主要用药方式为静脉注射，药效迅速、剂量准确;然而ADM静脉给药难以通过血脑屏障，且存在心脏毒性、骨髓抑制等不良反应，造成患者顺应性差，因此在一定程度上限制了其用于脑胶质瘤的治疗［2－3］。鼻腔给药(intranasal administration，i.n.)可以使药物通过上鼻甲吸收进入脑脊液，从而进入中枢神经系统，有效增加脑内药物浓度，如舒马曲坦［4］，它是已被FDA批准的用于治疗偏头痛的经鼻腔给药的药物。纳米粒(nanoparticles，NPs)是一种新型靶向胶态药物载体，具有低毒、高效、缓释等优点，且能实现药物的靶向传递［5］。Orthmann 等［6］亦指出纳米粒可有效转运药物通过血脑屏障，是脑靶向给药的理想载体之一。壳聚糖(chitosan，CS)作为一种新型的载体材料，可以控制药物释放、延长药物疗效、增强制剂靶向性，且具有安全无毒、生物相容性良好等优点，已被广泛应用于制备各类纳米粒。我们实验室以壳聚糖为载体材料成功制备了ADM纳米粒(ADM-CS-NPs)，然而关于该给药系统经鼻腔给药是否增加脑内ADM的浓度，目前国内外尚未见相关报道。因此本课题研究ADM-CS-NPs鼻腔给药后的脑内药动学特性，以期考察ADM-CS-NPs经鼻腔给药提高脑内ADM浓度的可行性。

1 材料

1.1药品与试剂盐酸阿霉素(浙江海正制药有限公司，纯度＞98%，批号090320);盐酸阿霉素标准品(中国药品生物制品检定所，批号110757-200206);人工脑脊液(1.0 mmol·L－1MgCl2，145.0 mmol·L－1NaCl，1.2 mmol·L－1CaCl2，2.7 mmol·L－1KCl，0.45 mmol·L－1NaH2PO4，1.55 mmol·L－1Na2HPO4，pH=7.4);水合氯醛(上海化学试剂采购供应五联化工厂，批号20090401);甲醇(色谱纯，美国 Honeywell Burdick＆Jackson公司，批号10071753);其他试剂均为分析纯。

1.2仪器Agilent1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司);透射电子显微镜(日本 Jeol公司);Malvern Measurement粒度测定仪(英国Malvern公司);OptimaMAX Uitrac-elrifuge超速离心机(美国Beckman公司);大鼠鼻黏膜给药装置(专利:ZL200520013525.5);微透析脑立体定位架及实验装置系统(美国BAS公司);微透析脑探针(美国BAS公司)。

1.3实验动物清洁级SD大鼠(300±10)g，♂，由浙江中医药大学实验动物中心提供(合格证号SCXK(沪2007-0005))。所有动物实验均按照浙江大学动物饲养和使用指南进行。

2 方法

2.1ADM-CS-NPs的制备称取1 mg ADM和10 mg壳聚糖，溶于10 ml体积分数为0.1的乙酸溶液中，用0.01 mol·L－1氢氧化钠溶液调节 pH值至5.0，在恒速磁力搅拌(900 r·min－1)下缓慢滴入1.2 g·L－1的三聚磷酸钠(sodium tripolyphosphate，TPP)溶液2 ml，继续同条件下搅拌30 min，探头超声3 min，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，得ADM-CSNPs胶体溶液。将制得的胶体溶液低温超速离心40 min(4℃，40 000 r·min－1)，弃去上清液，沉淀物用蒸馏水洗涤3次后冻干，即得ADM-CS-NPs冻干粉。

2.2ADM-CS-NPs的质量评价取适量冻干粉加水稀释一定倍数，滴于专用铜网上，用1.5%磷钨酸染色，自然晾干，用透射电子显微镜观察外观形态;用粒度测定仪测定ADM-CS-NPs的粒径;采用超速离心法［7］测定包封率，并测定载药量。

2.3脑透析液中ADM测定方法的建立

2.3.1色谱条件色谱柱:Platisil ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇 －0.2% 磷酸(50 ∶50);流速:1.0 ml·min－1;柱温:25℃;检测波长:233 nm;进样量:20 μl。

2.3.2专属性考察分别取空白透析液、空白透析液添加ADM对照品溶液、ADM-CS-NPs大鼠鼻腔给药后的透析液样品，按“2.3.1”项下条件考察专属性。

2.3.3标准曲线制备精密称取减压干燥至恒重的ADM对照品2.00 mg，置于10 ml量瓶中，用超纯水溶解、定容，作为ADM对照品贮备液。以人工脑脊液将对照品贮备液稀释成2.0、10.0、20.0、40.0、56.0、72.0、80.0、160 mg·L－1系列浓度的标准溶液，按“2.3.1”项下条件测定，记录峰面积，以峰面积(A)对药物质量浓度(C)进行线性回归，绘制标准曲线。

2.3.4精密度及方法回收率测定精密移取低(20.0 mg·L－1)、中(80.0 mg·L－1)、高(160 mg·L－1)3个浓度的标准溶液适量，按“2.3.1”项下条件操作，分别在1日内测定5次和连续测定5日(每日测定1次)，记录峰面积，考察方法的日内和日间精密度。

分别配制低(20.0 mg·L－1)、中(80.0 mg·L－1)、高(160 mg·L－1)3 个浓度的人工脑脊液样品各3份，按“2.3.1”项下条件操作，记录峰面积，计算方法回收率。

2.4脑内药动学研究

2.4.1大鼠脑微透析手术SD大鼠用10%的水合氯醛(300 mg·kg－1)腹腔注射麻醉，其头部固定于大鼠脑立体定位仪上，暴露颅骨，定位前囟，并以前囟为微透析探针定位的参考点。在前囟后5.2 mm、矢状线右旁开5.1 mm的骨表面处，用牙科高速钻机在颅骨上钻开一能插入微透析探针底座(MD-2251)的小洞。将微透析探针植入脑骨表面下8.0 mm，即右侧海马，并用牙托粉和颅骨螺钉将底座固定于颅骨上。术后大鼠单笼生理恢复7 d，温度(23±1)℃，相对湿度50% ～70%，昼夜12 h人工交替，自由饮食和饮水。

2.4.2微透析探针在体回收率运用反微透析法测定ADM脑微透析探针在体回收率。按“2.4.1”项下方法操作，微透析脑探针(MD-2200)埋植手术结束后，以浓度分别为10.0、50.0 和100 μg·L－1的ADM 灌流液灌流，流速为2 μl·min－1，每 30 min 收集1次透析液，共收集8 h。高效液相色谱法测定ADM的浓度，根据下述公式计算探针在右侧海马的在体回收率，用于透析部位透析液中实际药物浓度的校正。

Cdia、Cper和CBIF分别为透析液、灌流液和脑组织间液中的ADM浓度。在反透析过程中，假设探针周围脑组织间液中ADM浓度为零(CBIF=0)。

2.4.3给药方案及样品采集给药方案:将24只SD♂大鼠随机分成4组(每组6只):ADM-Sol鼻腔给药组［ADM-Sol(i.n.)］、ADM-Sol静脉注射组［ADM-Sol(i.v.)］、ADM-CS-NPs鼻腔给药组［ADMCS-NPs(i.n.)］和 ADM-CS-NPs静脉注射组［ADMCS-NPs(i.v.)］。给药剂量为 1.45 mg·kg－1ADM。实验前24 h大鼠禁食但自由饮水。

样品采集:按“2.4.1”项下方法进行手术，微透析脑探针(MD-2200)手术结束后灌流人工脑脊液，流速为 3 μl·min－1，平衡 30 min 后，流速调为 2 μl·min－1。采用大鼠鼻黏膜给药装置给药，同时使用自动恒温冷冻收集器收集透析液，每10 min收集1次，连续收集1 h，再每1 h收集1次透析液，连续自动收集24 h。收集结束后大鼠腹腔注射过量戊巴比妥钠麻醉后，用4%多聚甲醛溶液心脏灌注固定。取大鼠大脑4 μm冠状切片，显微镜下观察右侧海马部位。植入部位不正确数据不予使用。透析液样品按“2.3.1”项下条件测定，通过ADM在体回收率校正，得到各时间点的ADM实际浓度，绘制ADM海马部位的药物浓度－时间曲线。

2.4.4数据处理数据处理:Tmax和Cmax以实测值计，梯形法计算 AUC0→11h，统计矩法计算 MRT。用SPSS17.0软件进行方差分析，比较 ADM-Sol(i.n.)组、ADM-Sol(i.v.)组、ADM-CS-NPs(i.n.)组、ADM-CS-NPs(i.v.)组间Cmax、AUC0→11h、MRT 的差异。

3 结果

3.1ADM-CS-NPs的质量评价透射电子显微镜观察发现ADM-CS-NPs呈圆形或类圆形，表面圆滑，大小及分布较均匀，粒子之间未见粘连和聚集现象(Fig 1)。测得ADM-CS-NPs平均粒径为(98.80±0.70)nm，PDI为(0.084±0.001)。测得包封率和载药量分别为(78.37±1.52)%和(4.46±0.16)%。

Fig 1 Transmission electron micrograph of ADM-CS-NPs(×80 000)

3.2透析液中ADM方法学考察透析液中内源性物质不干扰样品的色谱分析，方法专属性强。脑脊液中ADM含量测定的标准曲线方程为:A=5.569 8 C+17.085，r=0.997 2(n=6)，线性范围2.0 mg·L－1～160 mg·L－1。低、中、高浓度的标准溶液的日内RSD分别为2.57%、1.72%、1.42%(n=5);日间 RSD分别为3.12%、2.37%、2.21%(n=5);低、中、高浓度的样品的方法回收率分别为93.61%、98.08%、101.34%，RSD分别为 2.98%、2.15%、1.80%(n=3)。说明方法精密度与准确度良好。

3.3脑内药动学结果

3.3.1ADM微透析脑探针在体回收率测定ADM微透析脑探针在大鼠海马部位的在体平均回收率为(13.54±0.35)%。

3.3.2药物浓度－时间曲线大鼠给予ADM-Sol(i.n.)、ADM-Sol(i.v.)、ADM-CS-NPs(i.n.)、ADM-CS-NPs(i.v.)后脑脊液中的平均药物浓度－时间曲线见Fig 2。

Fig 2 Profiles of mean concentration-time of ADM-CS-NPs or ADM-Sol via i.n.or i.v.administration in hippocampus of rats(±s，n=6)

3.3.3药动学参数大鼠给予 ADM-Sol(i.n.)、ADM-Sol(i.v.)、ADM-CS-NPs(i.n.)、ADM-CSNPs(i.v.)后主要药动学参数见 Tab 1，主要药动学参数柱状图见Fig 3。

4 讨论

纳米粒的制备方法有多种。Cetin等［8］采用离子交联法制备了bFGF壳聚糖纳米粒，所得纳米粒外观形态、载药量、包封率、粒径分布等指标均良好。本实验采用离子交联法制得的ADM-CS-NPs表面光滑圆整，平均粒径(98.80±0.70)nm、PDI(0.084±0.001)、包封率(78.37±1.52)%、载药量(4.46±0.16)%，各项指标均符合纳米粒鼻腔给药的要求，说明采用离子交联法制备鼻腔用ADM-CS-NPs切实可行。

大脑胶质瘤是颅内最常见的肿瘤，其病变范围较广泛，病变部位可以是海马、额叶、颞叶、枕叶、顶叶、基底节等，而脑微透析探针埋植于海马区是一种通用、可靠的方法，故本实验采用脑微透析在海马部位取样技术［9］。

Tab 1 Brain pharmacokinetic parameters of ADM-CS-NPs or ADM-Sol via i.n.or i.v.administration(±s，n=6)

Tab 1 Brain pharmacokinetic parameters of ADM-CS-NPs or ADM-Sol via i.n.or i.v.administration(±s，n=6)

Parameters ADM-CS-NPs(i.n.)ADM-Sol(i.n.)ADM-CS-NPs(i.v.)ADM-Sol(i.v.)Tmax/min 300.00 ±26.12 20.00 ±2.91 180.00 ±19.11 20.00±2.00 Cmax/mg·L －1 93.00 ±8.53 90.00 ±7.31 19.11 ±1.91 10.70 ±0.96 AUC0→11h/mg·h·L －1 17809.05 ±650.24 4736.70 ±53.40 5159.97 ±120.59 312.68 ±4.99 MRT/min 390.49 ±6.87 73.43 ±2.37 281.53 ±4.9923.39 ±1.32

Fig 3Histogram of brain pharmacokinetic parameters of ADM-CS-NPs or ADM-Sol via i.n.or i.v.administration(±s，n=6)

由 Fig 2 及 Tab 1 可知，ADM-CS-NPs(i.n.)与ADM-CS-NPs(i.v.)、ADM-Sol(i.v.)、ADM-Sol(i.n.)相比，ADM-CS-NPs(i.n.)的Cmax值最高，AUC0→11h值最大，说明 ADM-CS-NPs(i.n.)吸收入脑的药物量最多;Tmax值最大，表明ADM-CS-NPs(i.n.)起效最慢，具有缓释作用;而MRT值最大，提示ADM-CS-NPs(i.n.)在脑内消除缓慢。

Fig 3(A)、(B)结果显示，与静脉给药相比，鼻腔给药可提高脑内ADM药物浓度，有效实现脑内递药。ADM-Sol通过i.v.给药，血液分布容积较大，暴露于血脑屏障的药物量少，并且血脑屏障为静注药物入脑主要障碍［10］，故药物吸收入脑缓慢且脑内递药量减少;ADM-Sol通过i.n.给药，接触到有效吸收部位(鼻黏膜)的药物量多，且鼻腔具有独特的生理结构，可通过嗅神经通路和嗅黏膜上皮通路使药物直接绕过血脑屏障直接进入颅内，即鼻－脑通路发挥中枢治疗作用，故经鼻腔给药后脑内ADM浓度明显高于静脉给药。ADM-CS-NPs通过鼻腔给药的脑内递药量明显高于静脉注射给药，其原因一方面可能是由于壳聚糖表面荷正电，可通过静电作用与荷负电的鼻黏膜上皮组织结合，从而延长药物在鼻黏膜组织的滞留时间，促进药物在鼻腔的吸收。另一方面，载药纳米粒可能通过表面活性剂效应，紧密连接开放，胞吞作用，跨膜直接入脑，抑制外排泵作用等机制穿透血脑屏障［11－12］，从而提高ADM脑内浓度。Yue等［13］研究亦发现，经鼻腔给药后，脑内的石杉碱甲AUC明显高于经静脉给药。

Fig 3(C)、(D)结果显示，ADM制成纳米粒，可延长ADM在脑内有效浓度的持续时间，具有缓释、长效作用。原因可能有:ADM通过化学或物理作用分散于纳米粒内部或吸附于纳米粒表面，其中吸附于表面的药物释放较快，而分散于载体材料CS中的药物则需通过CS的小孔或随着CS的降解缓慢释放。Lee等［14］亦提出氧氟沙星制备成白蛋白微粒/纳米粒后，脑内释放超过48 h，具明显的缓释作用。

本实验以CS为载体材料，制备ADM-CS-NPs，成功建立大鼠脑微透析海马部位取样技术，研究了纳米粒和溶液剂两种剂型经不同给药途径对ADM脑内药动学的影响。结果显示ADM-CS-NPs鼻腔给药可以实现ADM脑内递药，并延长脑内有效药物浓度的持续时间，发挥长效作用。

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