低氧预适应对小鼠大脑HIF-α表达的影响

2012-05-31 07:22高冰张胜姜树原周立社邵国
当代医学 2012年2期
关键词:脑片室温低氧

高冰 张胜 姜树原 周立社 邵国

低氧预适应(hypoxicpreconditioning)是指预先给予1次或多次短暂、非致死性低氧刺激后,机体获得了对更严重甚至致死性缺血或缺氧的耐受性,是机体抗缺氧或缺血的一种内源性保护现象。现已在心、肝、肾等脏器发现了低氧预适应现象,其中脑低氧预适应的研究备受关注。低氧预适应后脑中缺氧诱导因子1(HIF-1)的变化已有较多报道,但多集中于预适应的迟发效应。本研究着重于观察短时间获得预适应后HIF-1的变化。本实验应用吕国蔚教授的整体水平低氧预适应模型,应用免疫组织化学(IHC)技术检测低氧预适应小鼠脑组织中在HIF-1α蛋白质水平表达的变化,探讨HIF-1活化对缺氧耐受的作用,为开展对脑缺血/缺氧研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 BSA(sigma),HIF-α兔多克隆抗体(Santa Cruz),生物素标记的羊抗兔IgG(中山生物公司),其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 动物模型复制 选择6~8周龄,体重18~22克的昆明种雄性小鼠有由内大动物室提供。按吕国蔚教授方法复制急性重复低氧预适应模型[1-2]。将小鼠置于含有新鲜空气、经过标定约125ml的广口瓶内,以橡皮塞密闭,记时、观察,待小鼠出现喘呼吸,翻转反射消失,立即取出,转移至另一相同容积并含有新鲜空气的广口瓶内,密闭、记时,如此重复4次。实验分3组:空白对照组(H0)、实验对照组(H1)、低氧预适应组(H4)。

1.3 小鼠灌注 小鼠经低氧处理后按5ml/Kg体重,给小鼠腹腔注射6%的水合氯醛。将麻醉好的小鼠仰卧固定于腊盘上。灌注装置管道清洗干净,用0.01M PBS冲注排除气泡。暴露胸和腹腔,沿胸骨剑突水平向两侧剪开皮肤至腋中线,然后向上剪至腋下,剪断膈肌,掀开整个胸廓,打开心包,暴露心脏。沿腹中线向下暴露整个腹腔。在心尖即左心室部剪开一个小口,将灌注插管插入左心室至主动脉,固定插管。剪开右心耳,可见静脉血流出。打开恒流灌注泵,灌注温的(35℃~37℃)0.01M PBS缓冲液,将电压开至10V,将血管内的血液全部冲干净,当肝脏及虹膜全变白时,可暂停灌注,时间约为5分钟,灌注量约为100ml。随后再灌注4℃预冷的4%多聚甲醛固定液,速度宜先快后慢,开始电压调为10V,当小鼠四肢、尾部出现抽动时即可将电压调为5V,慢速注入固定液,时间约为10分钟,灌注量约为150ml。灌注完毕后立即取小鼠完整全脑,放入4℃后固定液中进行后固定约8个小时。取出小鼠全脑置于20%蔗糖中进行置换。

1.4 切制免疫组织化学用脑片 待脑组织沉至瓶底表明置换完全,约12小时以上,随后可进行冰冻切片。将样品托盘嵌入冰冻切片机的插槽中,用滴管滴加水在托盘上作成冰台,冰台在切片机中平衡10分钟,用切片刀将冰台切修出一平整面。从20%蔗糖中取出脑组织,用刀片修整,再放入盛有异戊烷的塑料管中,浸入液氮中快速冷却,10秒可取出塑料管中的脑组织,小心置于冰台的平整面上,在组织周围滴加水形成冰托以稳定组织块。将样品托盘安置并固定在样品夹持臂上,调整切片刀和塑料挡板的位置,使组织块快要接触到刀口。连续切片,将组织切成厚度为40μm的脑片,置于PBS缓冲液中。脑片用PBS缓冲液洗3次,每次10分钟可放置于4℃冰箱中备用。

1.5 免疫染色 将上述脑片置于PBST中3小时,再置于1%小牛血清(BSA)封闭液中,在室温条件下封闭非特异抗原1小时,脑片用PBST洗3次,每次10分钟。将脑片置于PBST稀释的HIF-α兔多克隆抗体(1:500)中,室温条件下在摇床上孵育16小时,将脑片和PBST稀释的生物素标记的羊抗兔IgG二抗(1:300)室温下共孵育2小时,随后再和PBST稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素(Streptavidin)(1:300)在室温下孵育1.5小时,PBST漂洗3次,每次10分钟。将脑片置入新鲜配置的DAB显色液中,显色10分钟。将脑片取出置于Tris-HCl (pH 7.6)缓冲液中终止显色反应。将脑片裱贴在以明胶包被好的载玻片上,室温晾干。梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光学显微镜下观察。由于HIF-α定位于细胞核和细胞浆,以出现棕黄色高出背景色为阳性细胞。

2 结果

正常对照(H0)组小鼠脑部可见HIF-α阳性染色,低氧一次(H1)组HIF-α染色与H0组相似,重复低氧(H4)组小鼠在大脑皮层、海马CA1、3区锥体细胞层、分子层、多形细胞层、齿状回处HIF-α阳性染色均上升。

图1 低氧预适应小鼠脑HIF-1α的表达×15A:H0组, B:H1组, C:H4组,标尺:1mmFig.1. Expression of HIF-1αin brain of hypoxia preconditioned mice ×15 A:group H0, B:group H1, C:group H4, scale bar : 1mm

3 讨论

HIF-1为异二聚体,由HIF-1α和HIF-1β组成,其中α亚单位为120kDa,稳定性受环境氧分压调节,而β亚单位为91或94kDa,不受环境氧分压影响,因而在某些方面,HIF-1α的变化就可以代表HIF-1的变化。在常氧状态,肿瘤抑制蛋白pVHL结合在HIF-1α的ODDD区,通过泛素蛋白酶体系降解[3-4]。研究表明pVHL与HIF-1α结合的条件是HIF-1α的两个脯氨酸(pro-402,pro-564)被羟化。羟化酶需要分子氧和Fe2+以及抗坏血酸存在[5-6]。因此低氧或者Fe2+的拮抗剂及类似物(Co2+等)都能稳定HIF-1α。HIF-1α稳定积累后进入细胞核中,与HIF-1β形成异二聚体并与其它的转录调节因子一起调节含有缺氧应答元件的基因。

我们先前研究显示,急性重复低氧可以增加小鼠海马HIF-1α蛋白的表达和HIF-1的DNA结合[7]。HIF-1的脑保护主要是通过HIF-1靶基因的表达来实现的,其中VEGF和EPO是明确的具有脑保护作用的HIF-1的靶基因。两个分子的脑保护作用主要表现在降低脑梗死体积,通过上调抗凋亡基因Bcl-xL实现的[8]。除了明确的具有脑保护作用的HIF-1的靶基因,其他的潜在的具有脑保护的HIF-1的靶分子在抗脑低氧/缺血中也有重要作用[2-9]。在众多的HIF-1调节的基因的作用下,神经细胞得到了保护,维持了其基本功能及高级功能[10-11]。

我们的研究显示,低氧预适应可以在小鼠的大脑皮层、海马脑区及其他部位诱导HIF-1的表达。HIF-1在低氧预适应中处于关键位置,而大脑皮层和海马在维持脑功能中的作用是非常重要的。因此预适应诱导小鼠大脑皮层和海马各区HIF-1的表达,可能是脑保护形成的关键步骤。由于我们使用的免疫组织化学的方法研究的蛋白表达变化,其准确性不高。如果辅助以激光显微切割技术,则可以精确研究脑部各部位细胞的HIF-1表达变化情况。

[1]Lu GW.Tissue-cell Adaptation to hypoxia[J].Advances in Pathophysiology,1963,1:197-239.

[2]Shao G,Gong KR,Li J,et al.Antihypoxic effects of neuroglobin in hypoxia-preconditioned mice and SH-SY5Y cells[J].Neurosigna ls,2009,17(3):196-202.

[3]Maxwell PH,Wiesener MS,Chang GW,et al.The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis[J].Nature,1999,399(6733):271-275.

[4]Ohh M,Park CW,Ivan M,et al.Ubiquitination of hypoxia-inducible factor requires direct binding to the beta-domain of the von Hippel-Lindau protein[J].Nat Cell Biol,2000,2(7):423-427.

[5]Ivan M,Kondo K,Yang H,et al.HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation:implications for O2sensing[J].Science,2001,292(5516):464-468.

[6]Jaakkola P,Mole DR,Tian YM,et al.Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation[J].Science,2001,292(5516):468-472.

[7]Shao G,Gao CY,Lu GW.Alterations of hypoxia-inducible factor-1 alpha in the hippocampus of mice acutely and repeatedly exposed to hypoxia[J].Neurosignals,2005,14(06):255-261.

[8]Wen TC,Sadamoto Y,Tanaka J,et al.Erythropoietin protects neurons against chemical hypoxia and cerebral ischemic injury by up-regulating BclxL expression[J].J Neurosci Res,2002,67(6):795-803.

[9]Taie S,Ono J,Iwanaga Y,et al.Hypoxia-inducible factor-1 alpha has a key role in hypoxic preconditioning[J].J Clin Neurosci,2009,16(8):1056-1060.

[10]辛海涛,王卫宁.栀子苷对大鼠局灶性脑缺血模型缺血脑组织HIF-1α蛋白和RTP801的影响[J].当代医学,2010,16(36):25-26.

[11]Shao G,Zhang R,Wang ZL,et al.Hypoxic preconditioning improves spatial cognitive ability in mice[J].Neurosignals,2006,15(6):314-321.

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