脂联素受体在正常SD大鼠乳鼠心肌细胞的分布和表达1）

王 敏，柴颖儒，肖传实，卫 娜，边云飞

脂联素（adiponectin，APN）是由脂肪组织分泌的一种激素，在体内代谢平衡中发挥着重要的作用，多项研究显示脂联素有抗炎、抗动脉硬化、抗胰岛素抵抗的作用。近年研究发现，脂联素参与了缺血／再灌注损伤的心肌保护［1］，而脂联素的此种保护作用需要与其特异受体相结合而发挥作用，经典的脂联素受体（AdipoR）分为AdipoR1和AdipoR2，AdipoR1在骨骼肌中高度表达，AdipoR2在肝脏中高度表达［2］。近年发现T－钙黏蛋白（T－cadherin）是脂联素的又一新受体［3］，而在心肌细胞上，这三种脂联素受体是否均表达且表达量如何，目前文献报道较少。本研究采用体外培养乳鼠心肌细胞，研究心肌细胞上脂联素受体的表达情况，为脂联素对心肌受损后的保护作用提供理论支持和依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SD大鼠乳鼠，1d～3d龄，雌雄不限，由山西医科大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂和仪器 DMEM培养基（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶、4%多聚甲醛、Triton X－100（Solarbio，Spain）；PCR引物（上海生物工程技术有限公司）；兔抗鼠α－肌动蛋白一抗及FITC羊抗兔二抗（北京博奥森生物技术有限公司）；兔抗大鼠AdipoR1一抗、兔抗大鼠AdipoR2一抗、兔抗大鼠T－cadherin一抗（Santa Cruz公司，美国）；即用型SABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），其余试剂均为国产分析纯产品。HERA cell 150细胞培养箱、Mini－Sub Cell GT、Bio－Rad水平电泳系列、Ge Doc、Bio－Rad凝胶成像系统、Nikon TS100倒置显微镜、OlympusIX50荧光倒置显微镜，由山西医科大学第二医院干细胞研究中心提供。

1.3 方法

1.3.1 乳鼠心室肌细胞的培养及鉴定 经动物管理委员会同意，选用出生1d～3d龄的SD乳鼠，据 Webster等［4］方法并加以改进，无菌条件下操作，沿左腋处剪开胸廓取下心脏，采用Ⅱ型胶原酶进行反复吹打消化，差速贴壁法培养并分离纯化心室肌细胞，将细胞悬液以1×106／cm3的密度接种于培养板。约96h后，待贴壁心肌细胞伸出伪足，连成片状，搏动良好趋于同步化后进行干预，进入后续实验。

1.3.2 原代心室肌细胞的鉴定 采用免疫荧光法，针对胞浆中α肌动蛋白，兔抗鼠α肌动蛋白一抗及FITC－羊抗兔荧光二抗鉴定心肌细胞。

1.3.3 实验选用原代培养的正常单层心室肌细胞进行实验。

1.3.4 RT－PCR测定 采用 Trizol（TaKaRa）提取总 RNA，微量分光光度计测定RNA量，吸光度值（A260／280）均在1.8～2.0。将RNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增。目的基因引物序列AdipoR1：上游5′－CTGCTGGTCCTTCACAGACA－3′，下游5′－CATCCGCCTTACAAAGT－3′，172bp。AdipoR2：上游5′－ACCCACAACCTTGCTTCATC－3′，下游5′－GCTAGCCATGAGCATTAGCC－3′，233bp。T－cadherin：上游5′－GGCAGAGCTTTGAGATCCAC－3′，下游5′－GACTGGTCCCTCGTTGACAT－3′，206bp。甘油醛－3－磷酸脱氢酶（GAPDH）：上游5′－TGAACGGGAAGCTCACTGG－3′，下游5′－TCCACCACCCTGTTGCTGTA －3 307bp。条件：92℃预变性2min，92℃变形30s，55℃退火30 s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸5min。扩增片段通过凝胶成像系统扫描，利用Quantity one 4.6.2分析系统测定灰度值，目的基因PCR产物的相对表达含量＝目标基因电泳条带灰度值／GAPDH电泳条带灰度值。

1.3.5 细胞免疫组织化学方法检测 AdipoR1、AdipoR2、T－cadherin蛋白表达 将心肌细胞培养于盖玻片上，生长约96h后进行实验，采用SABC法染色。具体步骤：实验结束后，PBS漂洗3次，95%乙醇固定5min。PBS漂洗2min×5次，3%H2O2灭活内源性酶10min，蒸馏水冲洗，PBS漂洗，滴加一抗（1∶100），37℃孵育3h，PBS漂洗5min×5次。滴加生物素标记二抗，37℃孵育20min，PBS漂洗5min×5次。滴加SABC复合物，37℃孵育30min，PBS漂洗2min×3次。DAB显色，苏木素复染，自来水漂洗，在各级酒精中脱水，二甲苯透明，树脂封片，显微镜下观察、照相，以细胞浆着棕黄色为阳性。每张片子随机选取6个高倍镜视野（×200），用Image proplus 6.0专业图像分析系统测量每个视野的光密度值，然后计算出平均吸光度值（A）来表示细胞上各种蛋白的表达量。

1.4 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件进行分析处理，数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法。

2 结 果

2.1 乳鼠心室肌细胞鉴定 倒置相差显微镜下可见原代心肌细胞成簇生长，形态多样，呈梭形、星形及圆形等，细胞伸出伪足，折光性强，且搏动明显，核居中呈卵圆形。免疫荧光法鉴定：荧光倒置显微镜下可见细胞呈扁平多角形，胞浆呈绿色荧光阳性表达的细胞达95%，非心室肌细胞胞浆无阳性表达，可用于实验。

2.2 RT－PCR检测 RT－PCR的结果表明，AdipoR1、AdipoR2、T－cadherin的mRNA在SD大鼠乳鼠心肌细胞上均有表达，其中AdipoR1和T－cadherin的 mRNA表达量高，而AdipoR2的表达量较少，AdipoR1和T－cadherin的mRNA表达量与AdipoR2的表达量相比差异有统计学意义（P＜0.01）。详见图1。

图1 RT－PCR检测心肌细胞上AdipoR1、AdipoR2、T－cadherin的mRNA表达

2.3 免疫组织化学方法检测 分别在AdipoR1、AdipoR2和T－cadherin的免疫组化片子中，均可见心肌细胞胞浆中阳性的棕黄色颗粒，AdipoR1和T－cadherin的A值分别为0.43±0.02、0.41±0.03，两者差异无统计学意义（P＞0.05），但均高于AdipoR2的 A值（0.11±0.01，P＜0.01）。详见图2。

图2 SABC法检测心肌细胞AdipoR1、AdipoR2、T－cadherin蛋白表达（×200）

3 讨 论

脂联素是由脂肪组织分泌的一种激素，在血清中主要以三种形式存在：三聚体、六聚体和高分子质量（HMW）多聚体［5］，其在体内代谢平衡中发挥着重要的作用，多项研究显示脂联素有抗炎、抗动脉硬化、抗胰岛素抵抗的作用。近年研究发现，脂联素参与了缺血／再灌注损伤的心肌保护［1］。使用脂联素基因敲除鼠诱导缺血再灌注损伤，可见鼠的心肌梗死面积明显扩大，心肌细胞的凋亡和肿瘤坏死因子（TNF－α）的表达也明显增加，腺病毒介导脂联素的转染减少了梗死的面积、心肌细胞的凋亡以及肿瘤坏死因子的表达［6］。大量的研究表明，脂联素对缺血再灌注损伤具有保护作用，而脂联素的此种保护作用需要与其特异受体相结合而发挥作用。

Yamauchi等［2］应用分子克隆技术确定脂联素受体存在两种异构体，分别为AdipoR1和AdipoR2，AdipoR1分布广泛，在骨骼肌中含量丰富，AdipoR2则在肝脏中高度表达，AdipoR1、AdipoR2在结构上高度相似，都包含7个跨膜结构域和活化分子信号，与G蛋白耦联受体家族的布局相反，序列上的同源性也很低，氨基端在细胞内部，羧基端在细胞外部，AdipoR1、AdipoR2似乎不通过与G蛋白耦联发挥作用，而是直接连接到下游过氧化物酶体增生物激活受体－α（PPAR－α）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、p38有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号分子，传递脂联素的信息。近年，Hug等［3］通过分子克隆技术发现T－cadherin是脂联素的又一新受体，且是六聚体和高分子质量多聚体的脂联素受体，在心血管系统高度表达［7］。T－cadherin属于钙黏蛋白家族，由于T－cadherin缺失经典cadherin分子所有的跨膜区而经糖基磷脂酰肌醇（GPI）附着于细胞膜上［8］，所以T－cadherin或许是作为一种尚未被证实的复合物信号受体起作用，APN通过它传递代谢信号。

本研究结果显示，在乳鼠心肌细胞上三种脂联素受体的mRNA和蛋白均有表达，并以AdipoR1和T－cadherin表达为主，AdipoR2表达量较少，AdipoR1和T－cadherin与AdipoR2的表达差异有统计学意义（P＜0.01），推测脂联素对损伤后心肌的保护作用，可能主要通过与AdipoR1和T－cadherin结合而发挥作用，AdipoR2在损伤后心肌的保护中所起作用较小。有学者研究发现，脂联素通过与AdipoR1结合活化AMPK进而发挥生物学作用，并且AMPK信号通路对心肌具有保护作用，是心肌细胞肥大的重要调节机制［9］。另有学者研究认为T－cadherin在APN介导的心肌保护作用中起着直接并至关重要的作用，分别在心肌肥大和缺血再灌注损伤模型中，T－cadherin基因敲除鼠心肌肥大加剧，心肌梗死面积增大，并且认为APN对心脏的保护作用是通过结合T－cadherin主要激活AMPK信号途径实现的［10］。本次实验中发现AdipoR2在心肌细胞上有少量表达，在以往研究中发现AdipoR2主要分布于肝脏，在心脏组织中未检出其表达［2，11］。Ding等［12］研究在猪心脏中亦存在少量的AdipoR2的转录物，而由于AdipoR2在肝中高度表达，因此，推测脂联素可能主要通过AdipoR2来调节肝糖的输出和胰岛素的敏感性，AdipoR2的主要功能为参与血糖与胰岛素的调控。对于脂联素在心肌受损后的保护作用中，三种脂联素受体所起的作用还需要更进一步的实验来研究证实。

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