黄连解毒汤及其不同配伍组方成分溶出变化研究

刘冬敏， 刘树民， 祖金祥， 卢 芳， 荆 雷， 何 薇， 黄志桓

(黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040)

黄连解毒汤是清热解毒方中的经典方剂，该方由黄连、黄芩、黄柏、栀子组成。方中黄连和黄柏的主要有效成分为多种小檗碱型生物碱［1］，亦是本方的主要成分，文献［2-4］表明二药配伍可显著增加生物碱的溶出。黄芩的主要成分为黄酮类［5-6］，栀子的主要成分为环烯醚萜类［7-8］。本实验对黄连解毒汤及其可配伍组合的10个拆方的水煎剂及煎剂中的生物碱、黄酮类、环烯醚萜类进行了溶出变化的测定分析，并与原药材中的含有量进行比较，研究了传统水煎复方黄连解毒汤中有效成分生物碱、黄酮类、环烯醚萜类的溶出变化情况。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-2010A高效液相色谱仪(日本岛津);KQ-1007DB型数控超声波清洗仪;上海良平仪器表有限公司-FA2004型电子天平(d:0.0001 g)。

1.2 试剂 乙腈 (色谱纯，美国Fisher);甲醇(色谱纯，美国DIKMA);娃哈哈纯净水(吉林市吉林经济开发区磐石工业园);其他试剂为分析纯。

1.3 试药 黄连产自四川，黄柏产自四川，黄芩产自黑龙江，栀子产自江西，经黑龙江中医药大学中医药研究院王连芝副研究员分别鉴别为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch的干燥根茎，芸香科植物黄皮树Phellodendron amurense Rupr除去粗皮的干燥树皮，唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实。黄连解毒汤样品为将四味药按配方比例［黄连-黄芩-黄柏-栀子(3∶2∶2∶3)］的自提水煎液干燥品，共7批。黄连解毒汤11个配伍组方样品为按全方比例配伍自提水提物。

黄连碱对照品(上海融禾医药科技有限公司，批号为08109);栀子苷对照品(批号为110749-200613)，黄芩苷对照品(批号为110715-200514)，汉黄芩素对照品(批号为111514-200403)，盐酸小檗碱对照品(批号为110713-200609)，盐酸药根碱对照品(批号为0733-200005)，盐酸巴马汀对照品(批号为110732-200506)，黄芩素对照品(批号为111588-200501)均由中国药品生物制品检定所提供;绿原酸对照品(SIGMA-ALORICH，批号为048KBB)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Diamonsil(TM)-C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm);流动相为甲醇-水(含 0.1%醋酸)，梯度洗脱(洗脱条件见表1);柱温30℃;检测波长254 nm;体积流量 1.0 mL/min;进样量 10 μL。

表1 流动相梯度洗脱条件Tab.1 Gradient elution method of mobile phase

2.2 样品制备

2.2.1 供试品溶液的制备 1号煎剂(HLJD):600 g［黄连、黄芩、黄柏、栀子(3∶2∶2∶3)］浸泡2 h后，分别用8倍、6倍蒸馏水加热回流1.5 h，四层纱布三层脱脂棉过滤，合并两次滤液，60℃水浴挥干，电热鼓风干燥箱40℃烘干，过120目筛制成干细粉。2号(LQ):600 g［黄连、黄芩(3 ∶2)］、3号(LB):600 g［黄连、黄柏(3 ∶2)］、4号(LZ):600 g［黄连、栀子(3 ∶3)］、5 号(QB):600 g［黄芩、黄柏(2∶2)］、6 号(QZ):600 g［黄芩、栀子(2 ∶3)］、7号(BZ):600 g［黄柏、栀子(2 ∶3)］、8 号(LQB):600 g［黄连、黄芩、黄柏(3 ∶2 ∶2)］、9 号(LQZ):600 g［黄连、黄芩、栀子(3 ∶2 ∶3)］、10 号(LBZ):600 g［黄连、黄柏、栀子(3 ∶2 ∶3)］、11 号(QBZ):600 g［黄芩、黄柏、栀子(2 ∶2 ∶3)］、12 号(L):600 g黄连(600 g)、13号(Q):600 g黄芩(600 g)、14号(B):600 g黄柏(600 g)、15号(Z):600 g栀子(600 g)煎煮方法和干燥方法同1号煎剂。

精密称定1号煎剂生药250 mg于25 mL量瓶中，甲醇定容至25 mL，超声溶解30 min，放冷，用甲醇补足减失的量配成10 mg/mL供试液，取上清液，0.45 μm微孔滤膜过滤两次，取续滤液，得1号供试液。2～15号煎剂生药粉按比例同1号供试液分别配成 5、5、6、4、5、5、7、8、8、7、3、2、2、3 mg/mL 供试液体，取上清液，0.45 μm微孔滤膜过滤2次，取续滤液，分别得到2号～15号供试液。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取黄连碱对照品、栀子苷对照品、黄芩苷对照品、汉黄芩素对照品、盐酸小檗碱对照品、盐酸药根碱对照品、盐酸巴马汀对照品、绿原酸对照品、黄芩素对照品适量，加甲醇分别制成质量浓度为 10 μg/mL的溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，得到9个对照品溶液，供分析用。

2.3 参照峰的选择 将按照2.2项条件处理得到的供试品和9个对照品溶液，按2.1项条件进行色谱分析知，黄连解毒汤高效液相色谱图谱中10、16、20、21、23、24、38、45、49 号峰的色谱峰依次为绿原酸、栀子苷、黄连碱、盐酸药根碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素，因黄连为方中君药，且色谱图谱中以盐酸小檗碱峰面积最大且出峰稳定可靠，故选最强峰23号盐酸小檗碱峰为参照峰。

2.4 共有峰的确定 通过7批固形物的指纹图谱测定，比较其色谱图，确定共有峰为50个(见图1)。其中峰面积超过4%的色谱峰为16号，20号，23号，24号，38号，45号，49号峰。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 取黄连解毒汤同一批次供试品溶液，连续进样5次，测定高效液相图谱，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行统计，结果表明各共有峰的相对保留时间和相对峰面积基本没有明显变化(RSD＜3%)，符合指纹图谱的要求。

图1 黄连解毒汤高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of HLJD

2.5.2 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、24 h 进样检测，各主要色谱峰的相对保留时间RSD均小于1%，相对峰面积比值的RSD均小于3%，表明样品在24 h内稳定。

2.5.3 重复性试验 按前述方法制备供试品溶液5份，分别进样检测，各主要色谱峰的相对保留时间RSD均小于1%，相对峰面积比值的RSD均小于3%，表明方法的重复性良好。

2.6 黄连解毒汤10个配伍组方以及四味单味药高效液相图谱的建立 按黄连解毒汤指纹图谱梯度洗脱2.1项条件，将2.2.1项制备的2～15号煎剂供试液分别进样分析，得到10个配伍组方和4个单味药高效液相图谱(见图2);并且对10个配伍组方和4个单味药各峰的保留时间和峰面积进行统计。

图2 黄连解毒汤10个配伍组方和4个单味药高效液相图谱Fig.2 HPLC chromatogram of ten combinations and four single herbs of HLJD

2.7 色谱峰归属 由复方、10个配伍组方结合4个单味药高效液相谱图分析结果知，黄连碱、盐酸小檗碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、栀子苷、绿原酸、黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素在15个组方中峰面积所占比例均超过4%，且黄连碱、盐酸小檗碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀均属于生物碱成分，可粗略代表方剂中总生物碱的量;栀子苷属于环烯醚萜类成分，可粗略代表方剂中环烯醚萜的量;黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素均属于黄酮类成分，可粗略代表方剂中总黄酮类成分量。从以上9个成分分别对黄连解毒汤和10个配伍组方的色谱峰进行归属分析，结果见表2～4。由9个标准品分析四味单味药成分，可得黄连色谱峰中14号峰(L14)为黄连碱，15号峰(L15)为药根碱，17号峰(L17)为小檗碱，18号峰(L18)为巴马汀;黄芩色谱峰中5号峰(Q5)为黄芩苷，11号峰(Q11)为黄芩素，15号峰(Q15)为汉黄芩素;黄柏色谱峰中14号峰(B14)为小檗碱，15号峰(B15)为巴马汀;栀子色谱峰9号峰(Z9)为绿原酸，栀子色谱峰中12号峰(Z12)为栀子苷。

表2 黄连解毒汤及其配伍组方中生物碱类色谱峰归属Tab.2 Chromatographic peaks attribution of alkaloids in HLJD and its different combinations

3 讨论

3.1 色谱条件的确定 通过对样品在190～400 nm的三维色谱图和各对照品最大吸收波长的分析，选择 4 个不同波长进行检测，分别是 240［9］，280［10］，340［11］和 254［12］nm，再对 4 个波长下检测的色谱图进行比较，发现254 nm波长检测的色谱图基线较平，且能最大程度地反映黄连解毒汤中所含的3类组分的化学信息，故最后选择254 nm作为指纹图谱检测波长。

表3 黄连解毒汤及其配伍组方中黄酮类色谱峰归属Tab.3 Chromatographic peaks attribution of flavonoids in HLJD and its different combinations

表4 黄连解毒汤及其配伍组方中环烯醚萜类色谱峰归属Tab.4 Chromatographic peaks attribution of iridoids in HLJD and its different combinations

实验中首先考察了不同系统的流动相，包括乙腈-水，乙腈-水(含 0.1% 磷酸)，乙腈-水(含 0.1%醋酸)，甲醇-水，甲醇-水(含 0.1% 醋酸)，结果表明以甲醇-水(含0.1%醋酸)效果最好，本实验所采用的色谱条件能将各单味药主要成分在170 min内洗脱，且各类主要成分能得到良好的分离，从而保证最大限度体现四味药的特征。

3.2 生药水煎液中主要成分溶出变化分析 按2.2.1项方法煎煮得到的各配伍组方煎剂进行HPLC检测后，以单味黄连、黄芩、黄柏、栀子水煎液所得生物碱类、黄酮类、环烯醚萜类的色谱峰面积作为基准，分析黄连解毒汤和各拆方中上述三类物质溶出变化情况。结果可见，生物碱的溶出量与单味生药比较明显下降，但黄酮类和环烯醚萜类成分溶出量明显增加，且由于配伍的不同，煎液中各成分的相互影响不同，从而使单个化学成分和某类化学成分总量减少或增加也不尽相同。(1)生物碱类:LB配伍生物碱溶出增加为单味药的101.0%，剩余配伍组合均减少;其中四味药配伍损失最大为原来的43.3%;其次LQB配伍损失为原来的57%;LBZ配伍黄连碱、药根碱、小檗碱均少量损失，巴马汀少量增加，生物碱损失为原来的88.7%;LQZ配伍黄连碱、药根碱、小檗碱均大量损失，巴马汀少量增加;BZ小檗碱少量减少，巴马汀少量增加，故推测黄芩与黄连、黄柏配伍产生沉淀使生物碱溶出降低。(2)环烯醚萜类:LZ、BZ、LBZ配伍绿原酸、栀子苷等环烯醚萜类分别增加为原来的111.5%、124.5%、137.2%;QZ、QBZ、LQZ 配伍分别降低为 77.3%、79.2%、99.4%;LZ配伍绿原酸少量减少，栀子苷明显增加为原来的137.4%，故推测黄芩与栀子配伍使环烯醚萜类成分溶出降低，四药配伍溶出增加为112.6%。(3)黄酮类:LQ、QB、QZ、LQB、LQZ 配伍使黄酮类溶出分别增加为原来的 127.9%、144.9%、139.6%、159.6%、136.1%;QBZ 配伍使黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等黄酮类成分溶出明显减低为原来的25.3%;但四药配伍可以增加其的溶出为480.7%。

4 小结

目前对黄连解毒汤及其配伍拆方的成分研究国内外文献均较多，但均较不全面，本实验对黄连解毒汤可配伍组合的所有拆方进行了研究，得出了较为全面的分析结果。从本研究可知，虽然复方中生物碱的量明显少于单味生药，但临床上复方的疗效明显优于单味生药，说明多个生物碱以合理的比例同时作用于机体时产生的药效要优于单个生物碱的作用;而且除了生物碱之外其它两类主要成分溶出均有所增加，说明经过了几百年乃至上千年实践证明的传统复方黄连解毒汤其四药配伍在临床上产生的药效优于单味药及其它配伍组方的药效。本实验不仅为黄连解毒汤成分分析研究提供依据，并且为黄连解毒汤体内成分研究打下了良好的基础。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010.

［2］郭锡勇，张 凯.黄连解毒汤不同配伍对盐酸小檗碱溶出率的影响［J］.广西中医药，2002，25(3):49.

［3］金 瑾.黄连解毒汤化学成分分析及其抗高血脂症作用的研究［D］.吉林:吉林大学，2008:42-48.

［4］孙 健，温庆辉，李 夏，等.黄连解毒汤及其含药血清的化学成分及抗肿瘤作用对比研究［J］.中国中药杂志，2006，31(18):1526.

［5］李海丽.黄芩的研究进展［J］.化学工程与装备，2008，32(4):100.

［6］康杰芳，任婷婷.中药黄芩的研究进展［J］.陕西农业科学，2009，21(18):129.

［7］杨全军，范明松，孙兆林，等.栀子化学成分、药理作用及体内过程研究进展［J］.中国现代中药，2010，9(4):7.

［8］陈 雁，张现涛，张雷红，等.栀子化学成分及药理作用研究进展［J］.海峡药学，2010，12(22):1-5.

［9］沈 嘉，曹现峰，刘九飞.几种黄连解毒汤的HPLC指纹图谱研究［J］.中成药，2003，25(6):434.

［10］袁 立.黄连解毒汤传统饮片汤剂与配方颗粒汤剂药动学的对比研究［D］.长沙:中南大学药学院，2010:5.

［11］霍 达.黄连黄柏指纹图谱及成分研究［D］.北京:首都师范大学，2009:5.

［12］刘 韶，雷 鹏，李新中，等.黄连解毒汤饮片汤剂和颗粒汤剂的指纹图谱比较［J］.中国药师，2005，8(2):117.