无梗五加茎中3种酚酸类成分的HPLC-DAD-MS分析

金敏婷， 苏 瑞， 许 鑫， 张舒婷， 方洪壮

(佳木斯大学药学院，黑龙江佳木斯154007)

无梗五加Acanthopananx sessiliflorus(Rupr.Et Maxim.)Seem.为五加科五加属植物，始载于《神农本草经》，具有健肝强肾、益气、活骨疏筋等功效。无梗五加中的酚酸类成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用［1-5］。无梗五加的研究报道，多为黄酮、香豆素、多糖、皂苷类等活性成分的提取分离、分析及药理作用［6-10］，而关于酚酸类成分的定量测定鲜见报道。本研究通过HPLC-DAD-MS联用技术对无梗五加茎中化学物质进行定性分析，并结合文献相应的质谱［11］，确定了原儿茶酸、绿原酸及咖啡酸3种酚酸成分。采用HPLC多波长法同时测定3种酚酸成分，并对12个不同产地无梗五加茎中3种有效成分进行比较。所建立的定量方法简便、快速、准确可靠、应用性强。

1 仪器与材料

Agilent 1200型高效液相色谱/Agilent 6310质谱联用仪，包括:四元泵，自动脱气机，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器，6310型电喷雾质谱仪，Agilent色谱工作站。原儿茶酸、绿原酸及咖啡酸标准品，纯度≥99.5%(天津一方科技有限公司)，乙腈、甲醇为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)，磷酸、醋酸均为分析纯。12批样品，分别于2009年采自黑龙江、辽宁不同的县市区，经佳木斯大学宗希明高级实验师鉴定为无梗五加茎。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent Zorbax SB-C8柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);柱温为50 ℃;体积流量为1 mL/min;进样量为10 μL。定性分析与定量分析的流动相，分别为乙腈-甲醇-0.2%甲酸水溶液及乙腈-甲醇-0.4%磷酸水溶液，洗脱方式相同，流动相梯度洗脱见表1。定性分析色谱检测波长为270 nm，数据波长记录范围为200～400 nm。定量测定检测波长为260 nm和324 nm。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 The gradient elution program

2.2 质谱条件 ESI电离源，负离子模式扫描，离子阱质量分析器，干燥气(N2)体积流量为10.0 L/min，干燥气温度为350℃，雾化器压力为35.0 psi，质量扫描范围:50～1000 m/z。

2.3 混合对照品溶液制备 取原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸对照品适量，精密称定，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得原儿茶酸、绿原酸和咖啡酸混合对照品贮备液，原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸质量浓度分别为 2.0、5.0、6.0 mg/mL。

2.4 供试品溶液制备 取无梗五加茎(粉碎过50目筛)粉末约5.0 g，精密称定，置具塞圆底烧瓶中，精密加入50 mL甲醇，密塞，称定质量，水浴90℃下回流提取2 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足失质量，摇匀，滤过，浓缩提取液。用甲醇转移至25 mL量瓶，并稀释至刻度，滤过，取续滤液，经 0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.5 定性分析 在上述检测条件下，供试液在HPLC上经流动相乙腈-甲醇-0.2%甲酸水梯度洗脱分离，分别得到270 nm波长下的色谱图与一级质谱扫描总离子流图(见图1)。从图1可知，无梗五加溶液在保留时间25 min前，有3个较强的谱峰。分别提取3个谱峰的DAD所记录的光谱图(见图2)及MS-MS数据的一级、二级质谱图(见图3～5)。综合分析3种成分的光谱与其准分子离子峰及其碎片离子，经与对照品在相同检测条件下的色谱保留时间、光谱及质谱信息比对，并结合文献的数据与图谱［11］，确定3种成分分别为原儿茶酸、绿原酸和咖啡酸。

图1 供试液270 nm色谱图(A)和总离子流图(B)Fig.1 LC chromatograms(A)in 270 nm and total ion current chromatogram(B)of sample

图2 无梗五加中3种成分UV光谱图Fig.2 UV spectra of three compounds in sample

图3 化合物1的一级(A)、二级(B)质谱图Fig.3 MS，MS/MS spectra of compound 1

图4 化合物2的一级(A)、二级(B)质谱图Fig.4 MS，MS/MS spectra of compound 2

2.6 定量分析

图5 化合物3的一级(A)、二级(B)质谱图Fig.5 MS，MS/MS spectra of compound 3

2.6.1 色谱系统适用性 取供试液溶液，按设定的定量色谱条件进样测定，得到样品260 nm和324 nm下的色谱图(见图6)。原儿茶酸、绿原酸及咖啡酸的保留时间分别为 10.23、19.17 和 21.36 min;3种物质理论塔板数分别为20945，69196，63817。原儿茶酸、绿原酸及咖啡酸与相邻色谱峰的分离度大于1.5，分离度符合定量要求。

图6 样品的260 nm和324 nm HPLC色谱图Fig.6 HPLC chromatograms of sample at 260 nm and 324 nm

2.6.2 线性关系 分别精密量取混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL 置于 10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。取混合对照品溶液及其稀释液，按照2.1项下色谱条件测定3种成分的峰面积。以对照品质量浓度X(mg/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，分别绘制原儿茶酸、绿原酸及咖啡酸的标准曲线，并进行回归运算，结果表明，3种成分在各自浓度范围内线性关系良好。各成分的回归方程、线性范围及相关系数见表2。

表2 线性关系Tab.2 Linear relationship

2.6.3 精密度试验 取混合对照品溶液4.0 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。在上述的色谱条件下重复进样5次，测定色谱的峰面积，计算原儿茶酸、绿原酸及咖啡酸色谱峰面积的RSD分别为 0.82%，0.64%，0.75%，表明仪器的精密度良好。

2.6.4 重复性试验 取同产地的样品6份，按2.4项下方法制备供试品溶液，并按照2.1项下色谱条件进行分析，测定原儿茶酸、绿原酸及咖啡酸色谱峰面积的 RSD 分别为1.7%，0.34%，1.3%，实验方法重复性良好。

2.6.5 稳定性试验 制备供试品溶液，室温下放置，按照2.1 项下色谱条件分别于 0、2、4、8、12、24 h测定，计算原儿茶酸、绿原酸及咖啡酸峰面积的RSD 分别为1.7%，0.45%，1.4%，表明供试液在 24 h内稳定。

2.6.6 回收率试验 取已知含有量同产地样品9份，各约2.5 g，精密称定，每3份为1组。每组分别精密加入一定量的原儿茶酸、绿原酸及咖啡酸对照品溶液，按2.4项下方法制备低、中、高3个水平供试品溶液。按2.1项下色谱条件进行分析测定，计算原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸的回收率，结果见表3。

表3 回收率结果(n=9)Tab.3 Results of recovery(n=9)

2.7 样品的测定 分别取12个不同产地的无梗五加茎粗粉各约5.0 g，精密称定，按2.4项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，采用外标法计算样品中原儿茶酸、绿原酸及咖啡酸，不同产地无梗五加茎中3种成分质量分数，见表4。

3 讨论

3.1 化学成分确定 在HPLC上，混合对照品溶液中原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸与样品中的目标峰呈现相同的色谱保留时间;样品中3个目标峰的DAD检测表明，它们各自的紫外光谱与混合对照品中原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸的光谱一致;在质谱负离子模式下，目标峰与混合对照品中相应物持的准分子离子、主要碎片离子的质荷比相同。样品中3个目标峰对应的物质被确定为原儿茶酸、绿原酸和咖啡酸。

表4 样品测定结果Tab.4 The contents of 3 compound in samples from different areas

3.2 检测波长选择 由3种待测成分的DAD下的光谱图(图3)可知，原儿茶酸最大吸收波长分别是260 nm和295 nm，绿原酸、咖啡酸在295 nm和324 nm均有两个吸收峰。295 nm对于3种成分虽有较强吸收，但其强度不及260 nm、324 nm，故选择260 nm为原儿茶酸检测波长，324 nm为绿原酸及咖啡酸检测波长。

3.3 色谱柱选择 考察了相同规格(250 mm×4.6 mm，5 μm)的 3种不同的 Agilent Zorbax色谱柱(XDB-C18、SB-C18、SB-C8)，由于实验中所涉及的流动相酸性较强，舍弃了XDB-C18柱;另由于样品中极性成分较多，待测成分在SB-C18色谱柱未能有效地分离，而所涉及的3种成分在SB-C8柱上，分离效果良好、与邻峰的分离度均大于1.5，故最终选定Agilent Zorbax SB-C8柱。

3.4 流动相及柱温选择 比较了0.2%和0.4%磷酸溶液-乙腈-甲醇梯度洗脱体系，在使用0.2%磷酸溶液时，3种成分的色谱峰有部分拖尾现象，增加酸度后，峰形得到改善。在室温及30℃、40℃柱温条件下，3种成分的色谱分离不理想，升高柱温至50℃后，分离效果达到了定量要求。

由于磷酸水溶液不能挥发，易污染检测器，不宜用作液质分析流动相，故样品在进行质谱定性分析时，流动相中的酸水溶液的酸采用易挥发的甲酸。

3.5 3种成分质量分数比较 12个不同产地的无梗五加茎中绿原酸的量明显高于原儿茶酸和咖啡酸。同一成分因产地的不同，质量分数有较大的差别。辽宁产地原儿茶酸较黑龙江产地量大，其中以丹东(LN-1)的量为最大，而绿原酸与咖啡酸在黑龙江产地量较高，其中萝北(HLJ-6)产地量最多。

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