高效液相色谱法同时测定解风酒中阿魏酸、原儿茶酸和桂皮醛

王 宁

(湖南省怀化市食品药品检验所，湖南怀化418000)

解风酒是由当归、狗脊、桂枝、独活等多味中药制成的复方制剂。处方源于经验方，具有祛风除湿，舒经通络止痛的作用。用于风湿性关节炎及类风湿性关节炎。其现行质量标准只对制剂中活性成分当归、狗脊、桂枝进行薄层色谱鉴别，无相关的定量测定标准，为了更有效控制本品内在质量，采用高效液相色谱法对方中的阿魏酸、原儿茶酸及桂皮醛进行定量测定。

1 仪器与试药

岛津高效液相色谱仪，包括LC-20AT输液泵，SPD-M20Avp二极管阵列检测器，LCsolution工作站;AUW220D十万分之一电子天平(日本岛津公司)，CBL9960A超声波清洗器(上海科导超声仪有限公司)。

阿魏酸(批号:110773-200612)、原儿茶酸(批号:110810-200506)、桂 皮 醛 (批 号:110710-200513)对照品(均由中国药品生物制品检定所提供);解风酒(湖南怀化市中医院制剂，批号为100322、100902、101003);甲醇、乙腈、冰醋酸均为色谱纯;水为超纯水;其它试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相 A乙腈-B 0.1%冰醋酸溶液，梯度洗脱(0～35 min，75%B ～55%B);体积流量1.0 mL/min;柱温30℃;检测波长260 nm;进样量10 μL。按阿魏酸峰计算，理论板数不低于4000;按原儿茶酸、桂皮醛计算，理论板数不低于5000。

2.2 对照品溶液制备 精密称定经减压干燥18 h的阿魏酸 12.13 mg，原儿茶酸 12.51 mg，桂皮酸对照品5.24 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，作为混合对照品溶液，避光备用。

2.3 供试品溶液的制备 精密量取解风酒20 mL，置50 mL量瓶中加70%甲醇适量溶解，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)25 min，再加70%甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液即得。

2.4 阴性供试品溶液的制备 按处方比例称取缺当归、狗脊及桂枝以外的其余药材，按制备工艺制成阴性制剂，再按2.3项下的方法制备阴性供试品溶液。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性试验 分别精密吸取阴性供试品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL注入液相色谱仪，依法测定。阿魏酸、原儿茶酸及桂皮醛的保留时间分别约为 12.8，21.2，27.6 min，与混合对照品溶液的色谱保留时间一致;阴性供试品溶液在该色谱条件下对测定无干扰。见图1。

2.5.2 线性关系考察 精密吸取上述混合对照品溶液 2、4、6、8、10、20 μL 分别注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得阿魏酸、原儿茶酸、桂皮醛的回归方程分别为 A=2.33×106C－3.21×104(r=0.9999)，A=2.42 × 106C － 1.39 × 104(r=0.9999)，A=1.47 × 106C － 2.67 × 103(r=0.9999)。结果表明阿魏酸、原儿茶酸、桂皮醛分别在 0.02426 ～ 0.2426 μg、0.02502 ～ 0.2502 μg、0.01048 ～0.1048 μg 范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.5.3 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液，按2.1项下的方法连续进样6次，分别测定阿魏酸、原儿茶酸、桂皮醛的峰面积，峰面积RSD分别为 0.48%、0.99% 、0.93%。

2.5.4 重复性试验 取同一批号解风酒(批号:100322)6份 ，按2.3项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算，结果阿魏酸、原儿茶酸、桂皮醛的RSD 分别为 1.01%、0.69%、0.98%。

图1 解风酒HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of Jiefeng Wine

2.5.5 稳定性考察 吸取供试品 (批号:100322)，按2.3项下的制备条件，于室温放置0、4、8、12、24 h后按2.1项下的色谱条件进行，分别测定阿魏酸、原儿茶酸、桂皮醛的峰面积，RSD分别为0.74%、0.80%、0.65%，表明供试品溶液在 24 h 内基本稳定。

2.5.6 加样回收率试验 精密吸取同一批号样品(批号 100322，含阿魏酸 2.55 mg/瓶;原儿茶酸4.12 mg/瓶;桂皮醛 1.27 mg/瓶;每瓶 500 mL)10 mL，共9份，分别置50 mL量瓶中，分别精密加入混合对照品溶液(阿魏酸0.01213 mg/mL、原儿茶酸0.01251 mg/mL 和桂皮醛 0.00524 mg/mL)5.0，6.0和7.0 mL，按2.3项下的方法制备供试品溶液，并按2.1项下的色谱条件，依法测定，计算平均回收率，结果见表1。

2.5.7 样品测定 取3批样品，按2.2和2.3项下的方法分别制备对照品溶液和供试品溶液，依次对3批次样品(批号:100322，100902，101003)进行测定，结果见表2。

3 讨论

3.1 检测波长的选择 对阿魏酸、原儿茶酸及桂皮醛进行紫外全波段扫描，三者均在260 nm波长处有较大的紫外吸收，故采取260 nm为检测波长。

表1 加样回收率结果Tab.1 The results of Recovery test

表2 解风酒中阿魏酸、原儿茶酸、桂皮醛测定结果(n=3)Tab.2 Test results of samples(n=3)

3.2 提取溶剂与提取时间的选择 本实验分别采用50%甲醇、70%甲醇、甲醇作为提取溶剂，结果发现70%甲醇提取的样品含有量较其他溶剂高，且杂质影响较小;同时还考察了 15、25、35、45 min不同提取时间对样品的影响，结果25 min时提取最完全，且所测成分稳定。

3.3 柱温的设定 本方法采用的是梯度洗脱，在测定中不设柱温，色谱峰基线漂移较严重，样品峰拖尾明显，设定柱温后，可减少拖尾，基线漂移得到改善，峰形对称，但柱温设定不易过高，过高峰形变差，故柱温设定为30℃为佳。

3.4 流动相及洗脱方式的选择 参阅相关文献［1-11］，分别使用了甲醇-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等不同类型、比例的流动相进行实验，选用乙腈-0.1%冰醋酸溶液且进行二元梯度洗脱，结果表明，此洗脱相能更好地分离阿魏酸、原儿茶酸与桂皮醛峰，各主峰之间的分离度均大于1.5，且阴性样品对测定无干扰。

3.5 该品种为临床常用制剂，为完善其质量标准，用本法同时测定解风酒中阿魏酸、原儿茶酸和桂皮醛，方法简便、准确，能够有效控制解风酒的内在质量，为临床用药提供安全保障。

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