艾炷灸、电针对D-半乳糖衰老小鼠学习记忆能力和脑组织c-fos mRNA的影响

韦良玉 赵利华 王进声 姚 平 陈 煌 (广西中医药大学第一附属医院针灸科，广西 南宁 530023)

艾炷灸、电针对D-半乳糖衰老小鼠学习记忆能力和脑组织c-fos mRNA的影响

韦良玉 赵利华 王进声 姚 平 陈 煌 (广西中医药大学第一附属医院针灸科，广西 南宁 530023)

目的 观察艾炷灸、电针对D-半乳糖衰老小鼠学习记忆能力及相关脑区c-fos mRNA的影响。方法 健康3月龄昆明雄性小鼠体重(30±2)g72只，水迷宫检测后按随机区组设计分为:生理组、造模组、艾灸1、2组、电针组、尼莫地平组组，每组12只。造模组、艾灸1、2组、电针组、尼莫地平组，连续42 d颈背部皮下注射D-半乳糖造成小鼠衰老模型;生理盐水组连续42 d颈背部皮下注射等量生理盐水，12 d后艾灸1、2组，分别选取“足三里、悬钟”，“关元、百会”行艾柱灸治疗，电针组选取“足三里、悬钟”，尼莫地平组给予尼莫地平灌胃，均为隔日/次，共15次。采用水迷宫检测学习记忆、原位杂交检测各组小鼠大脑皮层、海马CA3区c-fos mRNA的表达。结果 模型组潜伏期较生理组、艾灸1、2组、尼莫地平组延长(P＜0.01或P＜0.05)，模型组原象比、垮台次数较其他各组缩短、降低(P＜0.01或P＜0.05)，模型组小鼠大脑皮质、海马CA3区c-fos mRNA表达的神经元密度较生理组、艾炷灸、尼莫地平灌胃治疗组降低(P＜0.01)。结论 艾炷灸“足三里、悬钟”，“关元、百会”穴位处方可能通过提高D-半乳糖衰老小鼠脑组织大脑皮层、海马CA3区c-fosmRNA的表达改善学习记忆能力。

艾炷灸;D-半乳糖;学习记忆能力;海马CA3;基因表达

近年来衰老基因学研究发现，即刻早期基因c-fos在脑中参与神经元的信号转导与凋亡过程，与认知功能和记忆有关，记忆的形成与即刻早期基因(IEGS)启动了细胞级联反应，最后引起突触重塑有关〔1〕。学习记忆的分子基础长时程增强(LTP)的诱导也伴有c-fos基因表达增强，因而，认为c-fos基因的表达和蛋白质合成是LTP能够维持数周乃至数月的物质基础，所以，人们将c-fos基因作为学习记忆功能的客观指标之一，在对学习记忆的研究中备受关注〔2〕。祖国医学认为脑为髓海，增龄等引起的脑衰老则为髓海失养:“髓海不足，则脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，懈怠安卧(《灵枢·海论》)。”“高年无记性者，脑髓渐空也”(《医林改错》)。历代医家都重视艾炷灸的养生保健作用，故有“保健灸”、“长寿灸”之说。本研究观察艾炷灸对D-半乳糖衰老小鼠学习记忆能力及相关脑区c-fos mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 健康3月龄昆明雄性小鼠体重(30±2)g 72只。均由广西医科大学动物中心SPF实验室提供(动物许可证号:SCXK桂2003-0003)。精制艾绒为苏州东方艾绒厂提供。主要仪器:Morris水迷宫系统(MWM，北京中科院生理所生产);奥林巴斯生物显微摄影系统(BX60 PM20型，日本);Matic Images Advanced 3.2病理图文分析系统(Motic China Group Co.，Ltd.)。专用试剂:D-半乳糖为国药集团化学试剂有限公司提供;尼莫地平片为山西亚宝药业集团股份有限公司提供;c-fosmRNA试剂盒购自武汉博士德公司。

1.2 动物分组 按随机区组设计将72只小鼠分为:生理组、造模组、艾灸1、2组、电针组、尼莫地平组，每组各12只。

1.3 方法

1.3.1 造模方法 参照文献〔3〕用D-半乳糖颈背部皮下注射，建立亚急性衰老小鼠模型。造模组、艾灸1、2组、尼莫地平组每天以 D-半乳糖按120 mg·kg－1·d－1颈背部皮下注射，连续42 d，同时对生理组颈背部皮下注射等量生理盐水42 d。

1.3.2 治疗方法 造模第13天开始治疗，艾灸1组选取小鼠“足三里、悬钟”，艾灸2组选用“百会、关元”进行艾柱灸治疗，时间选择上午9:00-11:30，选取小鼠双侧“足三里”(先灸)、“悬钟”(后灸)，及“百会”(先灸)、“关元”(后灸)，灸后用棉签轻轻按压穴位。三壮/穴/次。定位取穴按照胡元亮〔4〕《实验动物针灸手册》，“足三里”在膝关节下方，腓骨小头下3 mm处的肌沟中;“悬钟”在后肢外踝尖直上5 mm腓骨后缘处，“百会”在顶骨正中处，“关元”脐下正中线1 cm处。穴位选定后剪毛，施灸时涂凡士林以保护小鼠皮肤且便于固定艾炷，艾炷做得紧而结实(底座直径2 mm，高度5 mm，重量约13～15 mg)，用线香点燃，每壮时间约18～20 s，当小鼠挣扎时更换艾炷。电针组将输出电流正极接足三里穴，负极接悬钟穴，用20 Hz连续波，电流0.24～0.30 mA，以小鼠肢体轻微抖动，不嘶叫为度，每次3 min。尼莫地平灌胃组剂量按体表面积等效折算计算法，予12 mg·kg－1·d－1，灌胃。治疗方法均为隔日 1次，共 15次。生理组和造模组不做任何治疗性干预，但给予与各治疗组同样时间、同等程度的捉抓。

1.4 样本制备 再次Morris水迷宫结束后，将小鼠断头处死，于冰浴上取大脑，于4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。所有组织蜡块4 μm连续切片4张置60℃烤箱烤干。

1.5 指标检测

1.5.1 Morris水迷宫行为测试实验 (1)定位航行实验:共进行5 d。MWM实验的第2天至第6天，进行定位航行试验。平台位于第三象限，没于水下1 cm，小鼠入水点为各象限(分为1、2、3、4象限)池壁中点，每天分上下午两个时间段，每一个时间段每鼠训练4次，且每鼠每次训练间隔时间不能低于1 min。训练期间迷宫外参照物(包括实验者)及环境保持不变，训练每天在上午9:00～下午6:00进行，训练时将小鼠面向池壁(背向平台)由四个入水点放入水池中，测其60 s内成功进驻平台(小鼠找到平台并滞留其上5 s为成功进驻)所需时间(即逃避潜伏期)。如在60 s内小鼠不能成功进驻平台，则实验者将其引上平台并令其停留10 s，记录逃避潜伏期为60 s。潜伏期能综合反映出小鼠的学习、记忆及运动行为能力，其值越小，说明小鼠学习、记忆能力越强。(2)空间探索试验:实验第7天，进行空间探索实验:撤除平台，从1象限(原平台象限对侧)池壁中点将小鼠放入水中，电脑记录2 min内小鼠在原平台象限的游泳时间和游泳轨迹。原平台象比(原象比)越大，跨越平台次数(跨台次数)越多，说明小鼠学习、记忆及行为能力越强。两指标可综合反映出小鼠在平台撤除后所发生的探索反应，从而综合评判小鼠的学习、记忆及行为能力。

1.5.2 c-fos mRNA原位杂交检测 原位杂交试剂盒采用特异性针对c-fos的寡核苷酸探针，经地高辛标记。针对小鼠c-fos靶基因的mRNA序列为:(1)5'-TCCTT CTCCA GCATC GGCTC GCCTG TCAAC-3'，(2)5'-CTTCT ATGCA GCAGA CTGGG AGCCT CTGCA-3'，(3)5'-CTTAC ACGTC TTCCT TCGTC TTCAC CTACC-3'。原位杂交实验步骤严格按照试剂盒说明书操作进行。阴性对照，除不加探针杂交液外，其余步骤相同。

原位杂交阳性信号以细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性的神经元，采用Matic Images Advanced 3.2病理图文分析系统，在高倍(10×40)显微镜视野下于每张病理切片皮层部位、海马CA3区，分别选取不相重叠连续的10、6个视野，计数完整阳性神经元细胞数，其与视域参考面积(3 292.76、1 975.66 m2)的比值(单位面积神经元数)即是阳性神经元表达密度。

2 结果

2.1 实验前定位航行、空间探索试验指标 表1造模前，各试验组在定位航行、空间探索试验指标在差异不显著，提示在造模治疗前五组小鼠的学习记忆能力一致，无差别。

表1 造模前水迷宫各项指标(±s，n=12)

表1 造模前水迷宫各项指标(±s，n=12)

组别 定位航行原象比空间探索跨越次数(次/min) 潜伏期(s)模型组33.16±16.49 0.85±0.00 0.13±0.12生理组 32.39±16.07 0.85±0.00 0.12±0.12艾灸2组 39.19±17.82 0.85±0.00 0.12±0.08艾灸1组 36.33±16.04 0.85±0.00 0.19±0.13电针组 34.40±18.40 0.85±0.00 0.19±0.16尼莫地平组38.03±17.20 0.85±0.00 0.13±0.10

2.2 实验后在定位航行、空间探索试验指标 表2结果显示，实验后，在定位航行和空间探索实验中五个实验组经过重复测量数据资料分析及多个样本均数的方差分析:五组间比较差异具有显著性意义(P＜0.05或P＜0.01)。其中:(1)模型组“潜伏期”较生理组、艾灸1、2组、尼莫地平组延长(P＜0.01)，模型组“原象比”、“垮台次数”较其他各组缩短、降低(P＜0.01或P＜0.05)，(2)其余四组，尼莫地平组与生理组比较在潜伏期差异有显著性意义(P＜0.05)。其余各指标在4组间均无统计学差异(P＞0.05)。

表2 造模治疗后水迷宫各项指标(±s)

表2 造模治疗后水迷宫各项指标(±s)

与模型组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与生理组比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01

组别n定位航行原象比空间探索跨越次数(次/min) 潜伏期(s)模型组12 40.89±20.43 0.86±0.04 0.19±0.10生理组 10 25.14±17.892)1.02±0.092)0.36±0.112)艾灸2组 11 29.18±18.252)1±0.102)0.35±0.132)艾灸1组 10 31.14±19.742)3)0.99±0.132)0.35±0.132)电针组 12 31.31±18.652)4)0.99±0.122)0.33±0.141)尼莫地平组 11 33.58±19.002)4)1±0.141)2)0.31±0.181)

2.3 小鼠大脑皮质、海马CA3区c-fos mRNA的表达 各实验动物组大脑皮质、海马CA3区均有c-fos mRNA的表达，模型组大脑皮质、海马CA3区c-fos mRNA的表达细胞较少、染色浅，而生理组和各干预治疗组大脑皮质、海马CA3区c-fos mRNA的表达细胞明显增多、染色较深，各组大脑皮质、海马CA3区c-fos mRNA表达差异显著(P＜0.01)。模型组大脑皮质、海马CA3区c-fos mRNA阳性表达神经元密度较其他五组降低(P＜0.01，P＜0.05)，其他五组在大脑皮质c-fos mRNA阳性表达神经元密度无差别;尼莫定平组海马CA3区c-fos mRNA阳性表达神经元密度与艾灸1组比较差异显著(P＜0.05)。其余4组间海马CA3区c-fos mRNA阳性表达神经元密度无差异。各组大脑皮质、海马CA3区c-fos mRNA的阳性表达神经元密度见表3。

表3 大脑皮质、海马CA3 c-fos mRNA阳性神经元表达密度(±s，个/m2)

表3 大脑皮质、海马CA3 c-fos mRNA阳性神经元表达密度(±s，个/m2)

与模型组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与艾灸1组比较:3)P＜0.05

组别n大脑皮质 海马CA3模型组12 36.64±10.42 42.32±10.30生理组 10 48.12±3.51 58.41±6.022)艾灸2组 11 48.23±6.802)59.73±4.132)艾灸1组 10 47.13±5.052)54.16±4.952)电针组 12 46.63±3.031)54.87±3.462)尼莫地平组 11 44.59±2.811)52.14±2.241)3)

图1 光镜下各组大脑皮质、海马CA3区c-fos mRNA的表达(×40)

3 讨论

D-半乳糖造成衰老模型是因代谢过程中机体产生大量自由基，引起脑神经元的退行性变化而表现为学习记忆能力下降〔5，6〕。本实验结果提示通过艾炷灸和电针足三里、悬钟穴，艾炷灸百会、关元穴，尼莫地平灌胃治疗均能抑制D-半乳糖引起的脑功能损害，保护D-半乳糖衰老小鼠的学习记忆能力。无论在正常老化还是老年性痴呆，其病理改变主要见于海马和大脑皮质，其中海马又是最易受衰老影响的脑区之一〔7〕。海马CA3区被认为与空间辨别性学习记忆活动的关系尤为密切〔8〕。即刻早期基因c-fos是与学习记忆相关的基因，研究显示可能由于衰老神经元接受刺激的反应性减低所致，同样学习训练，青年组大鼠与成年、老年大鼠在海马区的c-fos的表达有显著差异〔9〕。以往研究显示D-半乳糖诱导小鼠的拟脑老化效应也表现有神经元细胞 c-fos mRNA水平的下降〔10〕，而耳针脑、肾穴〔11〕可以促进AD大鼠模型海马CA1区c-fos mRNA的表达，并与学习记忆呈正相关。本研究提示艾炷灸、电针、尼莫地平灌胃治疗从基因转录水平影响与学习记忆相关蛋白的c-fos表达，从而改善大脑的学习记忆功能，延缓脑衰老。

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3 龚国清，徐 本.小鼠衰老模型研究〔J〕.中国药科大学报，1991;22(2):101-3.

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〔2011-06-03收稿 2011-10-11修回〕

(编辑 曹梦园)

Effect of moxa cone moxibustion on learning and memory function and expression of c-fos mRNA in cerebral tissue of the senile mice induced by D-galactose

WEI Liang-Yu，ZHAO Li-Hua，WANG Jin-Sheng，et al.
The First Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medicine University，Nanning 530023，Guangxi，China

Objective To observe the influence of moxa cone moxibustion on learning and memory function and expression of c-fos protein in the related cerebral tissue with the memory function in senile mice induced by D-galactose injection.Methods 60 male mice(3 months old)were randomly and equally divided into the normal sodium control，model，moxa cone moxibustion 1(acupoint ST36 and GB39)，moxa cone moxibustion 2(acupoint DU20 and RN4)，nimodipine medicated groups.Rats in treatment and model groups were given with D-galactose injection for 42 days，while rats were injected the same dosage of normal sodium in the normal sodium control.12 days later，rats in three treatment groups were treated for every other day for one month.Spatial learning and memory were measured and observed with the Morris water maze(MWM)computer system and expression of c-fos protein in the cerebral cortex and hippocampal(CA3)of the senile mice was detected by immunohistochemical method.Results Significant difference was observed between the model and the other four groups in spatial learning and memory function，the escape latency of model group was prolonged，the spanning(original)platform frequency，the percentage of(original)platform quadrant were decreased(P＜0.01，P＜0.05).The neuronal density expression of c-fos protein in the cerebral cortex and hippocampal(CA3)in the model group were decreased compared with other groups(P＜0.01).Conclusions The moxa cone moxibustion prescription on ST36 and GB39，DU20 and RN4 can improve the learning and memory function of the senile mice induced by D-galactose，which may be related to the increasing expression of c-fos protein in the cerebral cortex and hippocampal(CA3).

Moxa cone moxibustion;Learning and memory function;D-galactose;Cortex;Hippocampus CA3;Gene expression

R245

A

1005-9202(2012)17-3702-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.042

广西自然科学基金(桂科自0832170)

赵利华(1967-)，女，博士，教授，主要从事针灸防治老年病学方面研究。

韦良玉(1958-)，女，主任医师，主要从事针灸防治老年病学方面的研究。