破血化瘀，填精补髓法对实验性脑出血大鼠血肿周围组织脑源性神经生长因子及TrkB蛋白表达的影响

任吉祥 林 雪任洪亮赵建军 王 健 (长春中医药大学附属医院，吉林 长春 3002)

破血化瘀，填精补髓法对实验性脑出血大鼠血肿周围组织脑源性神经生长因子及TrkB蛋白表达的影响

任吉祥 林 雪1任洪亮1赵建军 王 健 (长春中医药大学附属医院，吉林 长春 130021)

目的 探讨破血化瘀，填精补髓法对脑出血大鼠血肿周围组织脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体表达的影响。方法 应用Wistar大鼠复制脑出血大鼠模型，观察破血化瘀，填精补髓法方剂改善脑出血大鼠神经功能缺损的情况及对血肿周围组织BDNF及其受体酪氨酸激酶B(TrkB)蛋白表达水平的影响。结果 在给药第7天，与模型组比较，阳性药组、受试药各剂量组均明显增加了损伤脑区BDNF阳性细胞数量(P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05);在给药第3、7、14天，与模型组比较，受试药高剂量和中剂量均明显增加了损伤脑区TrkB阳性细胞数量(P＜0.05或P＜0.01)。结论 破血化瘀，填精补髓法方剂能明显改善脑出血大鼠神经功能缺损;其作用机制可能与上调脑出血血肿周围损伤组织中BDNF及受体TrkB蛋白表达有关。

脑出血;BDNF;TrkB;破血化瘀;填精补髓

脑损伤后的康复依靠脑的自身可塑性及功能重组，这些机制有多种表现方式，如神经营养因子及神经生长因子的增殖、突触功能的调节、细胞凋亡的抑制等。近年来，脑源性神经生长因子(BDNF)及其受体酪氨酸激酶B(TrkB)在脑损伤修复中的作用已被肯定。国内关于BDNF及TrkB的研究较多，但研究对象多缺血性脑梗死，有关中药治疗脑出血(ICH)的研究在国内并不多见。本研究观察破血化瘀，填精补髓法中药汤剂对实验性脑出血大鼠BDNF及TrkB表达的影响，探讨中药干预对脑出血后颅脑损伤的修复作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级Wistar大鼠，雌雄各半，体重250～300 g，由吉林大学药学院提供，大鼠许可证号:SCXK-(吉)2007-0003。破血化瘀，填精补髓法实验方剂:(水蛭8 g、生大黄10 g、生蒲黄 15 g、虻虫 5 g、瓜蒌 20 g、三七 10 g、石菖蒲 15 g、龟板胶10 g)，采用传统煎药方法，去渣后取药液进行浓缩，使1 ml药液中含生药1 g，4℃保存备用。醒脑健神胶囊(批号:921116，吉林省中医院制剂室)。BDNF及TrkB免疫组化试剂盒采用中杉金桥通用型二步法检测试剂盒(Pv6000)。大鼠脑立体定位仪(美国STOELTING公司);手持式牙科钻(上海齿科器械厂);光学显微镜(日本OLYMPUS公司);BMJ-1型生物组织包埋机(天津航空机电有限公司);RM2235型组织切片机(德国LEICA公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 150只Wistar大鼠随机分成7组:正常对照组6只;假手术组，模型组，受试药高、中、低剂量组，阳性药对照组每组24只。又分为 1、3、7、14 d四个时间点，每时间点6只。

1.2.2 模型制备 参照张朋奇等〔1〕方法制造实验性脑出血模型。实验动物用10%水合氯醛(350 mg/kg体重)腹腔麻醉，于大鼠腹侧尾根部1.5 cm处纵行切开，游离尾动脉，微量进样器抽取非肝素化尾动脉血50 μl。调整脑立体定位仪，使大鼠俯卧位固定于立体定位仪，使前、后囟基本在同一水平面上〔2〕。沿正中线切开头部皮肤暴露颅骨、前囟和冠状缝。参照大鼠脑立体定位图谱，以前囟为0点，于0点前0.4 mm、右侧旁开3 mm处钻孔，达硬脑膜表面。微量进样器垂直刺入颅骨外表面下6.0 mm处将50 μl动脉血注入右侧尾状核。以10 μl/min的速度，5 min左右全部注入。留针30 min，缓慢出针1 mm，留针10 min，然后缓慢将针完全退出，骨蜡封住钻孔。局部涂抹青霉素粉并缝合。假手术组操作过程同上，但不向脑内注血。

1.2.3 给药方法 正常对照组:自由饮食饮水。假手术组:生理盐水灌胃，1 ml/100 g，1次/d;模型组。同假手术组。治疗低剂量组:0.5 ml/100 g汤药灌胃，1次/d;中剂量组:1 ml/100 g汤药灌胃，1次/d;高剂量组:2 ml/100 g汤药灌胃，1次/d。阳性药对照组:予醒脑健神胶囊30 mg/100 g体重，溶于2 ml水灌胃，1 次/d。

1.2.4 大鼠神经功能评分 采用Longa评分法。0分:没有神经功能缺损;1分:左侧前爪不能完全伸展;2分:行走时，大鼠向左侧转圈;3分:行走时，大鼠身体向左侧(瘫痪侧)倾倒;4分:不能自发行走，有意识丧失。

1.2.5 免疫组化检测BDNF及TrkB蛋白表达水平 大鼠以水合氯醛麻醉后，切开胸腔，剥离心脏，止血钳夹闭下腔静脉和胸主动脉，剪开右心耳，静脉留置针刺进左心室，用0.9%生理盐水进行灌注，待流出清澈生理盐水后，改用10%多聚甲醛灌注，待大鼠颈部及上肢僵硬后，断头取脑，脑组织沿针道前后5 mm切开，取中段部分。组织固定，梯度脱水，石蜡包埋，切片机切片。进行常规苏木素-伊红(HE)染色。根据Pv6000说明书进行免疫组织化学染色。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行分析，各组指标以±s表示，组间相差显著性采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 BDNF免疫组织化学染色结果 在给药第1、3天，与假手术组比较，模型组BDNF阳性细胞明显增高(P＜0.01);与模型组比较，阳性药醒脑健神胶囊对损伤脑区BDNF阳性细胞数量并没有明显的影响(P＞0.05);单因素方差分析表明受试药剂量依赖性增加脑损伤时脑区BDNF阳性细胞数量，进一步分析表明受试药高剂量和中剂量明显增加了损伤脑区BDNF阳性细胞数量(P＜0.01，P＜0.05)。在给药第7天，与模型组比较，阳性药醒脑健神胶囊也明显增加损伤脑区BDNF阳性细胞数量(P＜0.01)，受试药高剂量、中剂量和低剂量均明显增加了损伤脑区BDNF阳性细胞数量(P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05)。在给药第14天，与假手术组比较，模型组BDNF阳性细胞明显增高(P＜0.05)，但与第7天比较，BDNF阳性细胞明显降低;与模型组比较，阳性药醒脑健神胶囊对损伤脑区BDNF阳性细胞数量并没有明显的影响(P＞0.05);单因素方差分析表明受试药剂量依赖性地增加了脑损伤时脑区BDNF阳性细胞数量，进一步分析表明受试药高剂量和中剂量明显增加了损伤脑区BDNF阳性细胞数量(P＜0.01，P＜0.05)，而低剂量组并没有看到相同的效应。见图1。

图1 各组大鼠1、3、7、14 d BDNF细胞数目比较

2.2 TrkB免疫组织化学染色结果 给药第1天，与假手术组比较，模型组TrkB阳性细胞明显增高(P＜0.01)。与模型组比较，阳性药醒脑健神胶囊对损伤脑区TRKB阳性细胞数量并没有明显的影响(P＞0.05);单因素方差分析表明受试药剂量依赖性增加脑损伤时脑区TrkB阳性细胞数量;进一步分析表明，只有受试药高剂量组明显增加了损伤脑区TrkB阳性细胞数量(P＜0.05)。在给药第3、7、14天，与模型组比较，阳性药醒脑健神胶囊对损伤脑区TrkB阳性细胞数量仍没有明显的影响(P＞0.05);受试药高剂量和中剂量明显增加了损伤脑区TrkB阳性细胞数量(P＜0.05或P＜0.01)。见图2。

图2 各组大鼠1、3、7、14 d，TrkB细胞数目比较

3 讨论

BDNF在中枢神经系统发育过程中具有不可替代的作用，能通过多种途径调控不同种类神经元的生存、发育、分化，维持神经突触传递〔3〕，调控神经元损伤后的存活、修复及细胞退行性变等，甚至在细胞凋亡过程中也起着关键作用〔4〕。神经营养因子通过与其特异性TrkB中的全长型受体结合，激活胞内的酪氨酸激酶活性，引导TrkB的自身磷酸化，激活钙调蛋白激酶(CaMK)、丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)、磷脂酸肌醇-3-激酶(PI3K)三条途径，并最终激活 cAMT反应元件结合蛋白(CREB)，起到抵抗自由基、拮抗氨基酸神经毒性、平衡细胞内Ca2+水平、抑制神经细胞凋亡〔5〕、促进血管内皮新生〔6〕等作用。本实验结果表明，各组大鼠在脑出血后，通过应用破血化瘀，填精补髓法中药干预，其神经功能缺失表现可有明显改善;3 d后，高、中剂量组各种相关症状即可消失。破血化瘀，填精补髓法各组与模型组比较，BDNF的表达在第7天达高峰，14 d可恢复到基本水平。重复的单因素方差分析显示，高剂量组效果最显著;其对TrkB表达的促进作用，可在第7天达峰，持续到第14天，并与其药物剂量呈正相关。

总之，运用破血化瘀，填精补髓法中药汤剂治疗脑出血大鼠可明显减轻神经功能缺损的症状，其机制可能与破血化瘀，填精补髓法中药汤剂显著促进BDNF及TrkB表达，启动BDNF-TrkB通路达到神经保护及修复作用有关。

1 张朋奇，朱贤立，赵甲山，等.一种大鼠脑内出血模型的建立与评价〔J〕.中国临床神经外科杂志，2005;10(1):33-5.

2 诸葛启钏译.大鼠脑立体定位图谱〔M〕.第3版.北京:人民卫生出版社，2005:17-25.

3 Takei N，Nawa H.Regulation of brain function by neurotrophin〔J〕.Chemistry，2007;76(1):111-23.

4 侯莉娟，乔德才.脑源性神经营养因子的研究现状〔J〕.中国康复医学杂志，2005;20(12):940-2.

5 刘 芳，张伟玲，邹 伟，等.神经生长因子对急性神经损伤保护作用机制初探〔J〕.中国急救医学，2006;26(10):687-8.

6 王雅丹，胡 豫，孙春艳.Akt、ERK1/2活化在脑源性神经营养因子促血管新生中的作用〔J〕.中国病理生理杂志，2007;23(5):833-8.

〔2012-01-17收稿 2012-02-10修回〕

(编辑 袁左鸣)

R743

A

1005-9202(2012)17-3719-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.048

1 长春中医药大学

王 健(1970-)，男，主任医师，博士，主要从事中医内科脑病研究。

任吉祥(1977-)，男，博士，主治医师，主要从事中医内科脑病研究。