肺气肿小鼠骨骼肌、心肌γ-GCS表达变化

汪金峰 李云桥 (华中科技大学同济医学院附属协和医院老年科，湖北 武汉 430022)

肺气肿小鼠骨骼肌、心肌γ-GCS表达变化

汪金峰 李云桥 (华中科技大学同济医学院附属协和医院老年科，湖北 武汉 430022)

目的 探讨γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)在肺气肿小鼠骨骼肌、心肌中的表达变化与细胞凋亡的关系。方法 采用单纯熏香烟法制作肺气肿小鼠模型。运用TUNEL法检测骨骼肌、心肌细胞凋亡，免疫组化技术检测上述组织γ-GCS的蛋白水平，结果以平均光密度值表示。结果 肺气肿小鼠骨骼肌心肌细胞凋亡均增加(0.20±0.07 vs 0.36±0.04，t=－4.583，P=0.001;0.20±0.02 vs 0.29±0.07，t=－3.433，P=0.009)。肺气肿小鼠骨骼肌、心肌γ-GCS的蛋白水平分别为0.210±0.026、0.38±0.09，与正常组骨骼肌、心肌γ-GCS的蛋白水平0.086±0.008、0.19±0.03相比，差异均具有统计学意义(t=7.917，P＜0.001，t=－4.616，P=0.001);肺气肿小鼠骨骼肌与心肌γ-GCS蛋白水平相比，差异具有统计学意义(t=－4.092，P=0.014)。结论 肺气肿小鼠骨骼肌、心肌细胞凋亡增加，其机制可能与γ-GCS介导的氧化/抗氧化失衡有关，骨骼肌较心肌细胞凋亡加重，可能与γ-GCS表达减少有关。

肺气肿;γ谷氨酰半胱氨酸合成酶;小鼠;骨骼肌

目前关于肺气肿的发病机制学说主要有:氧化/抗氧化失衡、蛋白酶/抗蛋白酶失衡以及慢性气道和肺部炎症形成〔1〕等。研究表明，氧化应激产生的活性氧是造成多系统、多器官氧化损伤的共同基础。还原型谷胱甘肽(GSH)是细胞内外主要的抗氧化剂，对维护组织细胞正常结构、功能及代谢起重要作用。γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)是GSH生物合成中的关键酶〔2〕。已有研究表明:γ-GCS高表达于慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺泡和支气管上皮细胞中〔3〕。为进一步探讨γ-GCS对全身其他器官的影响，本文就肺气肿小鼠模型骨骼肌、心肌组织中γ-GCS的表达变化与细胞凋亡的关系进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 免疫组织化学试剂盒购自北京中杉公司;γ-GCS抗体为美国Santa Crus公司产品。

1.1.2 动物模型和标本采集 雄性昆明种小鼠，体质量24～26 g(华中科技大学同济医学院动物研究所提供)，分为正常对照组(10只)及肺气肿组(20只)。肺气肿组制模采用单纯熏香烟法〔4〕，以常规饲料喂养小鼠，吸烟时动物置于带有透气孔的玻璃箱内，每次通过吸烟器燃烧5根去过滤咀的红双喜牌香烟(焦油含量每支13 mg，烟雾烟碱每支1.3 mg)，使动物暴露于烟雾中被动吸烟，每周吸烟6 d，每日吸烟2次，每次约1～1.5 h。16 w后，颈椎脱臼法处死动物，取出趾长肌、心肌组织，于10%甲醛溶液固定，采用免疫组织化学染色。

1.2 方法

1.2.1 肺组织切片的制作 熏香烟16 w后，颈椎脱臼法处死动物，迅速开胸，小心取出肺组织，在肺叶中线矢状面切取肺组织并以石蜡包埋，制作6 μm厚的切片，并用HE染色。

1.2.2 骨骼肌、心肌γ-GCS蛋白表达及细胞凋亡测定 蛋白表达采用亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法(ABC)免疫组织化学染色试剂盒，根据试剂盒提供的操作说明进行;细胞凋亡用末端转移酶标记技术(TUNEL)检测，图像经HMIAS-2000型全自动医学彩色图像分析系统进行分析。

1.3 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件进行分析，数据资料以±s表示，两组计量资料比较采用t检验。

2 结果

2.1 肺气肿小鼠模型肺组织病理特点 在肺组织切片中，可见肺气肿模型小鼠肺泡间隔变薄甚至断裂，多个肺泡融合形成肺大泡，呈现肺气肿样特征改变，而正常对照组小鼠各肺泡壁连接清楚，肺泡大小均一，未见明显肺泡融合，见图1。

2.2 骨骼肌心肌组织内γ-GCS蛋白表达及细胞凋亡的变化以辣根过氧化物酶标记的二抗显示正常组及肺气肿组骨骼肌、心肌组织内γ-GCS蛋白表达，在肺气肿组与底物大量结合，显示明显的棕黄色，而正常组棕黄色底物明显减少，见图2。肺气肿小鼠骨骼肌心肌细胞凋亡均增加(P=0.005)。肺气肿小鼠骨骼肌、心肌γ-GCS蛋白水平与正常组比较，差异均有统计学意义。肺气肿小鼠骨骼肌与心肌γ-GCS蛋白水平相比，差异具有统计学意义(P=0.014)。见表1。

TUNEL法检测显示棕黄色底物在肺气肿组骨骼肌、心肌组织切片中明显增多，而正常组骨骼肌、心肌组织切片中较少看到，细胞凋亡程度与棕黄色底物浓度呈正相关，见图3。

图1 两组小鼠肺组织病理特点(HE，×200)

图2 正常组及肺气肿组骨骼肌、心肌组织内γ-GCS蛋白表达(免疫组化，×400)

图3 正常组及肺气肿组骨骼肌、心肌组织内细胞凋亡(免疫组化，×400)

表1 两组骨骼肌、心肌凋亡及γ-GCS蛋白表达(±s，n=20)

表1 两组骨骼肌、心肌凋亡及γ-GCS蛋白表达(±s，n=20)

组别 骨骼肌凋亡 γ-GCS心肌凋亡 γ-GCS正常组0.20±0.07 0.086±0.008 0.20±0.02 0.19±0.03肺气肿组 0.36±0.04 0.210±0.026 0.29±0.07 0.38±0.09t值 －4.583 7.917 －3.433 －4.616P值0.001 ＜0.001 0.009 0.001

3 讨论

氧化应激在调节细胞功能及维持内环境的稳态中具有重要作用。低水平的氧化应激介导细胞的生长和细胞信号传导〔5〕。但过高的氧化应激水平又可导致疾病的发生，如肺气肿。氧化剂对细胞信号传导的影响主要位于含酪氨酸的受体和酶的转录后修饰水平，从而损害结构蛋白、脂质和DNA，并最终诱发凋亡。研究显示，凋亡细胞的氧化应激水平增加〔6〕，与凋亡之间存在着恶性循环。

γ-GCS能被氧化剂、炎症介质、抗炎因子、抗肿瘤药物、重金属等激活，在调控内源性抗氧化剂GSH的合成中扮演关键性的作用〔7〕。前期研究发现:正常情况下，肝、肺以及肾组织均有一定量的γ-GCS基因表达;在肺气肿状态下，肺组织中γ-GCS的基因表达更为明显〔2〕。本研究中发现骨骼肌、心肌中也有γ-GCS的表达，尤其是在肺气肿状态下，其表达明显增加。γ-GCS表达增加是机体通过增强抗氧化能力，从而达到降低氧化性损伤的一种自我防护反应〔8〕。本研究结果也证实，模型小鼠心肌γ-GCS含量较骨骼肌表达增多，而心肌凋亡程度却较骨骼肌凋亡程度轻。因此，骨骼肌是较心肌更易受损伤的部位，可能是肺气肿患者容易出现骨骼肌萎缩和功能紊乱的重要机制之一。

1 Taraseviciene-Stewart L，Voelkel NF.Molecular pathogenesis of emphysema〔J〕.J Clin Invest，2008;118(2):394-402.

2 林书典，戴爱国.慢性阻塞性肺疾病大鼠主要脏器γ-GCS活性及其mRNA表达变化〔J〕.心肺血管病杂志，2007;26(3):161-4.

3 林书典，戴爱国，唐朝克.γ谷氨酰半胱氨酸合成酶在大鼠慢性阻塞性肺疾病中的表达〔J〕.中华结核和呼吸杂志，2004;27(5):348-9.

4 庞宝森，王 辰，张洪玉，等.维A酸β-胡萝卜素牛磺酸对大鼠实验性阻塞性肺气肿的预防作用及机制探讨〔J〕.心肺血管病杂志，2004;23(1):41-6.

5 Colavitti R，Pani G，Bedogni B，et al.Reactive oxygen species as downstream mediators of angiogenic signaling by vascular endothelial growth factor receptor-2/KDR〔J〕.J Biol Chem，2002;277(5):3101-8.

6 Pierrou S，Broberg P，O'Donnell RA，et al.Expression of genes involved in oxidative stress responses in airway epithelial cells of smokers with chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2007;175(6):577-86.

7 林书典，戴爱国.γ-GCS和慢性阻塞性肺疾病〔J〕.国外医学·呼吸系统分册，2004;24(6):391-4.

8 许建英，孙 娜，庞 敏.γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、转化生长因子β1在吸烟大鼠肺组织中的表达〔J〕.山西医科大学学报，2009;40(2):103-7.

〔2012-02-29收稿 2012-03-12修回〕

(编辑 袁左鸣)

R56

A

1005-9202(2012)17-3721-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.049

汪金峰(1963-)，男，主治医师，主要从事老年医学及呼吸病学研究。